[发明专利]一种驼背鲈鳃细胞系、构建及其应用方法

说明书

本发明涉及一种驼背鲈鳃细胞系、构建及其应用方法，属于细胞生物学技术领域，所述细胞系于2021年10月22日保藏在中国武汉武汉大学的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23097。本发明还提供了驼背鲈鳃细胞系的制备方法，经传代15次后，该细胞系可稳定培养，目前已稳定传35代；该方法制备的细胞系可放置于液氮中长期保存，复苏后可继续正常培养。驼背鲈鳃细胞系可用于神经坏死病毒检测及相关病理学研究、以及外源质粒转染相关实验。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体地涉及一种驼背鲈鳃细胞系、构建及其应用方法。

背景技术

鱼类细胞培养最早见于1960年Wolf等报道的虹鳟性腺细胞系构建，截至目前已建立近300个淡海水鱼类不同组织细胞系。随着生物技术的不断发展，鱼类细胞系已被成功用于鱼类病毒学、毒理学、生理学、免疫学、遗传育种学等多个研究领域。

驼背鲈(Cromileptes altivelis)，俗名老鼠斑,隶属鮨科、石斑鱼亚科、驼背鲈属，主要分布于印度洋和太平洋的热带地区。该鱼肉质嫩滑，鲜味香浓，营养价值高，为目前最名贵的石斑鱼类，在我国香港、广州等地售价达800～1000元/kg。近年来随着人工繁育技术的突破，驼背鲈逐步实现了规模化生产。然而，伴随着生产规模的不断扩大，创伤弧菌和哈氏弧菌等细菌性疾病，以及虹彩和神经坏死等病毒性疾病不断爆发，给驼背鲈工厂化养殖业造成巨大的损失。开展驼背鲈免疫机制及病原菌致病机理研究对解析驼背鲈致病机制，开展相关疫苗研发工作具有重要意义。然而，与其他石斑鱼种类相比，驼背鲈价格极高、且养殖环境要求极为苛刻，开展活体实验研究成本极大。因而构建驼背鲈细胞系，利用细胞系开展相关研究成为解决上述问题的有效方法之一，同时也可为病毒分离、鉴定及功能基因的研究提供实验素材。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种驼背鲈鳃细胞系、构建及其应用方法。

本发明是通过采用如下技术方案实现的：

一种驼背鲈鳃细胞系，所述细胞系于2021年10月22日保藏在中国武汉武汉大学的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23097。

本发明还提供所述驼背鲈鳃细胞系的构建方法，所述方法包括鳃组织取样、原代培养、传代培养、细胞冻存及复苏；

所述的鳃组织取样：无菌状态下，剪取驼背鲈鳃组织，用含青霉素和链霉素的L15培养基清洗，而后将其剪成小块；

所述的原代培养：将驼背鲈鳃组织块贴于细胞培养瓶培养面，再将细胞培养瓶轻轻反转180°，加入常温完全培养基，待3-5h后反转，使培养基与组织块接触；置于25-28℃培养；8-10d后鳃细胞从原组织迁出，再经3-4d用新的完全培养基更换1/3-1/2原培养基。

所述的传代培养：

1)待原代培养鳃细胞铺满细胞瓶底85％-95％时，倒掉原培养基，并用无菌的PBS小心清洗2-3遍，加入室温含EDTA的0.25％胰酶，静置消化1-2min，再用移液器吹打1min，显微观察细胞变圆，加入完全培养基反复吹打，悬起细胞；

2)收集含细胞的培养液，1000-1200g离心5-8min，以1:2传代，加入完全培养基，于26℃恒温培养箱传代培养；

3)待传代至15代后细胞以1:3比例进行传代，4-5d传代一次；

所述的细胞冻存及复苏：

1)冻存培养液配制组分及体积比为70％L15培养基+10％DMSO+20％胎牛血清；L15培养基中含有400IU/ml青霉素和400μg/ml链霉素；