[发明专利]一种乌蔹莓及其伪品的快速鉴别方法

说明书

本发明公开了一种用于鉴定乌蔹莓与4种伪品的特异性引物对。本发明提供了1对鉴别引物，为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。采用特异性引物对待测样品进行扩增时，如果能实现有效扩增，则待测样品中含有乌蔹莓。如果不能实现有效扩增，则可以证明待测样品中不含有乌蔹莓。本发明能快速地鉴定出乌蔹莓，且其灵敏度高，稳定性好。使用此方法鉴别乌蔹莓，只需要通过DNA提取、PCR扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别，这为乌蔹莓的快速准确鉴定提供了依据。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药鉴定领域，特别涉及一种能快速鉴定乌蔹莓及其伪品的引物和PCR方法。

背景技术

中药材乌蔹莓为葡萄科乌蔹莓属植物乌蔹莓(Cayratia japonica)的全草。现代研究表明，乌蔹莓可有效防治咽喉肿痛、腮腺炎、毒蛇咬伤、痈肿、疔疮、风湿痛、黄疸、痢疾、咯血、尿血等病症。由于乌蔹莓在形态上与绞股蓝、葎草等植物较为相似导致目前市售乌蔹莓质量存在安全性问题。其伪品主要包括绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)、葎草(Humulus scandens)和雪胆属植物，如马铜铃(Hemsleya graciliflora)和曲莲(Hemsleyaamabilis)等。因此建立乌蔹莓快速、准确的鉴定方法，对保证临床用药安全是十分重要的。

发明内容

本发明人基于叶绿体基因组psbA-trnH序列，设计了1对乌蔹莓的位点特异性引物，通过PCR扩增和凝胶电泳等操作，即可达到快速准确鉴定检测材料中是否含有乌蔹莓。

1.一种鉴定乌蔹莓和伪品的特异性引物，其特征在于所述引物为WLM-3F、WLM-3R，其序列为：

表1 1对乌蔹莓的特异性引物

2.一种基于特异性引物鉴定乌蔹莓的PCR方法，其特征在于，所述鉴定方法包括如下步骤：

(1)待测样品DNA的提取

(2)用权力要求1所述的引物进行PCR反应，获得扩增产物。DNA扩增体系包括：25μL反应体系(超光速mix酶12.5μL，WLM-3F、WLM-3R引物各1μL(10pmol)，DNA模板1μL(约50ng)，ddH₂O 9.5μL)；反应体系：95℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环后72℃延伸8min。

(3)获得的PCR扩增产物使用核酸染料进行染色，分别取10μL扩增产物上样，后通过1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。如果(2)的产物在凝胶电泳谱图中观察到分子量为491bp的单一DNA条带，则可以确定待测样品中含有乌蔹莓；如果在凝胶电泳谱图中观察不到分子量为491bp的单一DNA条带，则可以确定待测样品中不含有乌蔹莓。

3.一种乌蔹莓的PCR鉴别方法，其特征在于，待测样品为乌蔹莓植物。

附图说明

图1：WLM-3F+WLM-3R特异引物鉴别，该引物能够特异性扩增获得乌蔹莓叶绿体基因组psbA-trnH上491bp的鉴别条带，而对其他伪品则没有扩增产物。M：marker；XY：乌蔹莓中国药科大学校园；HeN：乌蔹莓河南；QLS：乌蔹莓青龙山；AH：乌蔹莓安徽；SX：乌蔹莓陕西；LS：绞股蓝老山(JGL-LS)；LC：葎草；MTL：马铜铃；QL：曲莲；CK：阴性对照。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

(1)对乌蔹莓及其伪品进行收集，各取100mg样品使用冷冻研磨仪进行研磨粉碎，使用核分离液清洗至上清液无色，离心后使用移液枪小心弃去上清液，再使用CTAB法提取样品总DNA。

表2核分离液配置表