[发明专利]南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量PCR内参基因及其筛选方法和应用

说明书

本发明公开了南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量PCR内参基基因及其筛选方法和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明公布的15个内参基因来源于南京椴不同组织的全长转录组序列，并依据序列信息设计15对特异性实时定量PCR引物，分别对南京椴不同组织及胁迫处理的植物材料，进行实时定量PCR扩增，获得内参基因的Ct值，对候选内参基因的稳定性由强到弱进行排序，最后对排序结果进行综合评价，筛选获得不同组织及胁迫处理条件下最稳定的内参基因及组合。本发明筛选获得的内参基因及其引物，具有特异性强，适用性广的优点，填补了南京椴内参基因研究的空白。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量PCR内参基基因及其筛选方法和应用。

背景技术

南京椴是我国重要的乡土树种，也是优良的园林观赏树种和城市行道树。同时南京椴是集蜜源、香花、材用、纤维用及药用等多用途经济树种。随着栽培及推广工作的逐步开展，全国范围内南京椴栽培初具规模。然而，目前该属植物遗传育种及功能基因的研究领域尚属空白。在南京椴中，仅分离并鉴定了药用成分萜类合成途径中的关键酶HMGR编码基因，基因表达分析中采用了actin基因作为内参基因。但是在研究中发现不同物种及组织中稳定表达的内参基因不尽相同，即使同一物种不同生理条件下的内参基因也并非一成不变。植物中内参基因的选择并没有绝对的通用性。因此，在分析目标基因表达模式时，应根据实验条件的改变而选择合适的内参基因。目前南京椴内参基因筛选未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量PCR内参基基因及其筛选方法和应用，进行南京椴不同组织及不同胁迫处理条件下内参基因的筛选，为南京椴功能基因分离及表达分析提供可靠保障，从而为揭示南京椴生物特性的分子机理方面奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明提供南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量PCR内参基基因，包括15个内参基因，所述内参基因分别为：18s核糖体RNA(18srRNA)、肌动蛋白(ACT1)、网格蛋白(AP47)、水孔蛋白(AQP)、延伸因子(EF1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、组蛋白(HIS)、蛋白磷酸酶(PP2α)、核糖体蛋白S13(RPS13)、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)、SKI互作蛋白(SKIP)、微管蛋白TUA、微管蛋白TUB、泛素缀合酶(UBC)、多聚泛素基因(UBQ10)，所述内参基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15所示。

本发明还提供用于实时荧光PCR扩增上述的南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量PCR内参基基因的引物，用于扩增18srRNA的引物序列为SEQ ID NO.16/SEQ IDNO.17，用于扩增肌动蛋白的引物序列为SEQ ID NO.18/SEQ ID NO.19，用于扩增网格蛋白的引物序列为SEQ ID NO.20/SEQ ID NO.21，用于扩增水孔蛋白的引物序列为SEQ IDNO.22/SEQ ID NO.23，用于扩增延伸因子的引物序列为SEQ ID NO.24/SEQ ID NO.25，用于扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶的引物序列为SEQ ID NO.26/SEQ ID NO.27，用于扩增组蛋白的引物序列为SEQ ID NO.28/SEQ ID NO.29，用于扩增蛋白磷酸酶的引物序列为SEQ IDNO.30/SEQ ID NO.31，用于扩增核糖体蛋白S13的引物序列为SEQ ID NO.32/SEQ IDNO.33，用于扩增S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的引物序列为SEQ ID NO.34/SEQ ID NO.35，用于扩增SKI互作蛋白的引物序列为SEQ ID NO.36/SEQ ID NO.37，用于扩增微管蛋白TUA的引物序列为SEQ ID NO.38/SEQ ID NO.39，用于扩增微管蛋白TUB的引物序列为SEQ IDNO.40/SEQ ID NO.41，用于扩增泛素缀合酶的引物序列为SEQ ID NO.42/SEQ ID NO.43，用于扩增多聚泛素基因的引物序列为SEQ ID NO.44/SEQ ID NO.45。