[发明专利]一套用于水稻的人工基因编辑系统

权利要求书

1.一套用于水稻的人工基因编辑系统，所述人工基因编辑系统包括：

第I调节元件，其编码如氨基酸序列I的核苷酸序列；所述氨基酸序列I为依次从N端到C端串联的SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列；

第II调节元件，其为依次从5’端到3’端串联的第II-1核苷酸序列和第II-2核苷酸序列；所述第II-1核苷酸序列包括靶核苷酸序列；所述靶核苷酸序列中的靶位点为处于所述靶核苷酸序列的从5’端到3’端方向的2至10位置中的碱基C，所述靶核苷酸序列来源于水稻的基因组中，并且所述靶核苷酸序列中含有水稻基因组中待突变的靶位点；所述第II-2核苷酸序列包括来源于化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的sgRNA核酸序列，所述第II-2核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示；所述第II-1核苷酸序列和所述第II-2核苷酸序列转录融合，其产物能引导第I调节元件编码的蛋白至水稻基因组中待突变的靶位点处，并将所述靶位点处的碱基进行突变；

当所述第II调节元件为多个时，包含在每一个所述第II调节元件中的第II-1核苷酸序列两两不相同；

所述靶核苷酸序列通过如下方式确定：

1）确定水稻基因组上需要被改造的核苷酸序列；

2）判断步骤1）中所确定的需要被改造的核苷酸序列为基因组中的特异性序列，

并根据所述第I调节元件来判断待突变的核苷酸位点的碱基发生突变后引起的改变是否符合预期；或者根据所述第I调节元件来判断待突变的核苷酸位点的反向互补碱基发生突变后引起的改变是否符合预期；

对于符合预期者，所述待突变的核苷酸位点即为潜在的靶位点；

3）在需要被改造的核苷酸序列或其反向互补序列中筛选靶标序列：向潜在的靶位点的3ʹ端方向搜索以确认存在被所述第I调节元件编码的氨基酸序列所识别的识别模序，并且所述靶位点处于所述识别模序5ʹ端上游的-19至-11的位置，由此确定的所述识别模序5ʹ端上游17至21个核苷酸序列为所述靶核苷酸序列；所述识别模序为5’-N₁GN₂-3’，其中，所述N₁和N₂独立地为A、G、C和T中的一种。

2.根据权利要求1所述的人工基因编辑系统，其特征在于，所述第I调节元件的核苷酸序列为适于在水稻中表达的核苷酸序列，所述第II调节元件的核苷酸序列为适于在水稻中发生转录的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的人工基因编辑系统，其特征在于，编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No. 5所示；编码如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No. 6所示；编码如SEQ ID No. 3所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No. 7所示。

4.根据权利要求1所述的人工基因编辑系统，其特征在于，所述第II-1核苷酸序列的3’端还包括含有IIS型限制性内切酶的酶切位点的克隆位点，所述靶核苷酸序列通过所述第II-1核苷酸序列上的所述克隆位点而被克隆到其中，以使所述第II-1核苷酸序列与第II-2序列转录融合；

当所述第II调节元件为多个时，用于克隆不同靶核苷酸序列的所述IIS型限制性内切酶的酶切位点两两不相同。

5.根据权利要求1所述的人工基因编辑系统，其特征在于，所述靶核苷酸序列为所述识别模序5’端上游的17至21个核苷酸序列，淘汰含有连续五个T的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的人工基因编辑系统，其特征在于，所述人工基因编辑系统还包括在所述第I调节元件的5’端的用于水稻中的，且用于启动所述第I调节元件转录的第一启动子；和/或所述人工基因编辑系统还包括在所述第II调节元件的5’端的用于水稻中的，且用于启动所述第II调节元件转录的第二启动子。

7.根据权利要求6所述的人工基因编辑系统，其特征在于，所述第一启动子为RNA聚合酶II型启动子；和/或第二启动子为RNA聚合酶III型启动子。