[发明专利]一种以5-羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌株、构建及其应用

说明书

本发明公开了一种以5‑羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌株、构建及其应用，属于生物技术领域。该工程菌株含有5‑羟色氨酸脱羧酶基因，通过在宿主菌株中表达，最终催化5‑羟基色氨酸产生血清素。该方法操作简单，无环境污染，且产量高、纯度高、成本低，为工业化生产血清素提供了依据，本发明终产物血清素产量最高可达到31.9g/L。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种以5-羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌株的构建及其应用。

背景技术

5-羟色胺最早是从血清中发现的，又名血清素，别名5-HT。其广泛存在于哺乳动物组织中，特别在大脑皮层质及神经突触内含量很高，它也是一种抑制性神经递质。在外周组织，5-羟色胺是一种强血管收缩剂和平滑肌收缩刺激剂。

5-HT作为神经递质，主要分布于松果体和下丘脑，能够参与痛觉、睡眠和体温等生理功能的调节。中枢神经系统5-HT含量及功能异常可能与精神病和偏头痛等多种疾病的发病有关。

据报道，血清素主要依赖于化学合成，但存在合成工艺流程长、使用的原料种类多、条件苛刻和三废多等缺点；而生物合成血清素属于绿色合成工艺，具有三废少且易处理等特点，应用前景广阔。而现有技术生物合成血清素产量较低，底物有大量剩余，不能达到工业化生产的要求。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种以5-羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌株，该工程菌株通过表达5-羟色氨酸脱羧酶可以一步将5-羟基色氨酸转化为血清素，无需利用操作繁杂的化学方法，且产量高、纯度高、成本低、对人体和环境友好，为血清素的大规模工业化生产提供依据。

为实现上述发明目的，本发明包括以下内容：

以5-羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌株，其含有5-羟色氨酸脱羧酶基因，能够过表达生成5-羟色氨酸脱羧酶，所述5-羟色氨酸脱羧酶基因为GmDDC、PaDDC、CcDDC、TcDDC或CgDDC，所述GmDDC、PaDDC、CcDDC、TcDDC和CgDDC的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

上述GmDDC、PaDDC、CcDDC、TcDDC和CgDDC基因分别来源于Galleria mellonella(GmDDC)、Papioanubis(PaDDC)、Cyprinuscarpio(CcDDC)、Triboliumcastaneum(TcDDC)或Crassostreagigas(CgDDC)。5-羟色氨酸脱羧酶的核苷酸序列是根据大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化后的序列。

按上述方案，所述5-羟色氨酸脱羧酶基因GmDDC、PaDDC、CcDDC、TcDDC或CgDDC对应编码的5-羟色氨酸脱羧酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

上述工程菌中，所述过表达5-羟色氨酸脱羧酶的方法是将所述5-羟色氨酸脱羧酶基因置于质粒载体的启动子之后进行表达，所述5-羟色氨酸脱羧酶在工程菌株中通过T7RNA聚合酶启动转录。

提供一种以5羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)利用PCR技术或酶切方法对载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；

(2)利用特异性引物分别对5-羟色氨酸脱羧酶基因进行PCR扩增，回收得到目的片段；

(3)利用无缝克隆方法将所述含有5-羟色氨酸脱羧酶基因回收片段与所述线性化载体片段进行连接、转化，得到重组表达载体；

(4)将所述重组表达载体转入宿主细胞，得到工程菌株。