[发明专利]一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用，具体突变位点为：将野生型逆转录酶M‑MLV的第67位氨基酸从S突变为T，第303位氨基酸从F突变为R，第312位氨基酸从L突变为S，第432位氨基酸从L突变为G，第479位氨基酸从N突变为F，第524位氨基酸从D突变为Q。该酶是通过人工合成表达载体，利用优选的宿主细胞，经IPTG诱导表达获得。经改造后的一种重组突变型逆转录酶的活性温度为37‑65℃，逆转录效率是野生型逆转录酶的41.9倍，对常见干扰物的耐受能力明显提高。其性能明显优于野生型M‑MLV，并在与市场化M‑MLV的性能比较中显示出优势。

技术领域

本发明涉及基因工程、酶工程领域，具体地说涉及一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用。

背景技术

逆转录酶是分子生物学研究和应用中广泛使用的一种工具酶。它以RNA为模板合成DNA，是进行RNA分析和检测的重要手段，在基因表达分析、基因功能研究、病原体检测、遗传病筛查等诸多领域均有广泛的使用。

莫罗尼鼠白血病病毒（Moloney Murine Leukemia Virus, M-MLV）逆转录酶是目前常用的逆转录酶之一，该酶是一条多肽链，包含N端聚合结构域与C端RNase H结构域。但是该酶在应用中仍存在诸多的限制。

首先，M-MLV逆转录酶适宜反应温度为37~42℃，过低或过高的反应温度均会使其反应效率显著下降或失去活性。RNA逆转录合成cDNA程序中最大的挑战在于RNA双股互补结构复杂，在相对低温时RNA会形成二级结构，这种二级结构会影响转录合成cDNA的效率。一般来说，可以通过提高RNA逆转录反应温度来降低RNA二级结构的产生。然而，普通M-MLV难以在高于55℃的温度下良好地工作。此外，较低的温度耐受也限制了它与交叉引物恒温扩增等核酸扩增技术的整合。

其次，普通 M-MLV的逆转录效率仍不理想，难以满足如快速核酸检测等应用的需求。如新型冠状病毒的核酸检测对检测时间要求极其严格，普通M-MLV的转录效率较低，从而影响检测效果。

最后，逆转录酶的实际应用中，往往会遇到样本中含有的干扰物质影响，降低其cDNA的合成效率。普通M-MLV对诸如乙醇、肝素、胍盐等常见干扰物的耐受浓度较低，限制了它的应用。

因此，对普通M-MLV进行优化和改良提高其适用反应温度范围、合成效率、抗干扰性能，对于分子生物学研究和检测具有十分重大的意义，并具有广阔的市场前景。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种耐高温、抗干扰且具有高效逆转效率的新型重组逆转录酶及其及其表达基因序列；本发明还有一个目的是提供其相应的重组载体和宿主细胞；本发明还有一个面对是提供前述逆转录酶的制备方法及其在RT-PCR或恒温扩增反应上的应用。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述的重组突变型逆转录酶，包括如SEQID NO.1所示的氨基酸序列，其表达基因序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列是通过在野生型M-MLV逆转录酶（GenBank:AAC82568.2）氨基酸序列第67位、第303位、第312位、第432位、第479位和第524位进行定点突变获得，将突变型逆转录酶氨基酸序列经密码子优化获得如SEQ ID NO.2所示的表达基因序列。

本发明提供了包含前述基因序列的重组载体，其至少包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。重组载体选用包括但不限于pET-30a(+)、pET-28a、pPICZα A、pHT43、pFastBac1的任意一种作为载体，优选采用pET-30a(+)或pET-28a，其具有Nde I和Hind III双酶切位点和良好的宿主细胞兼容性及高效转录启动体系。