[发明专利]一种柱状黄杆菌毒力蛋白在病原检测和弱毒株制备中的应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，公开了一种柱状黄杆菌毒力蛋白在病原检测和弱毒株制备中的应用，所述的柱状黄杆菌毒力蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。利用该毒力蛋白，设计抗体，可用于柱状黄杆菌病原菌的检测。通过在柱状黄杆菌上缺失编码该蛋白的毒力基因，可获得柱状黄杆菌弱毒株，利用该弱毒株，可以实现柱状黄杆菌感染鱼类细胞系和鱼体的能力下降；进而作为候选疫苗株，实现对柱状黄杆菌引发的柱形病的免疫防控。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种柱状黄杆菌毒力蛋白在病原检测和弱毒株制备中的应用。

背景技术

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是鱼类柱形病(在我国也称为细菌性烂鳃病)的病原。该菌是一种革兰氏阴性细菌，在全球范围的自然环境和人工养殖环境中广泛存在，并给淡水养殖业带来严重威胁。我国人工养殖的几乎所有经济鱼类如草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis)和鳜鱼(Sinipercachuatsi)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)和黄颡(Pelteobagrus fulvidraco)等都极易感染该菌，并引发巨大的经济损失(农业部渔业渔政管理局，2014)。

鱼类在感染柱状黄杆菌后通常表现为体色发黑、鳃部溃烂、背部溃疡和鳍条坏死等一系列症状。根据感染进程不同，严重程度有所差异。对于柱形病的防治，目前仍主要采取抗生素或化学药物治疗的方法。但是，抗生素的大量使用会导致耐药菌株的增加，并具有抗性基因传播的风险。化学药物的大量使用，则会污染生态环境，引起养殖水域内环境失衡。因此，开展柱形病的快速检测及疫苗的研发，对于降低鱼类感染柱形病的风险，推动淡水养殖的可持续发展具有积极意义。

近年来，尽管已有62株柱状黄杆菌经过全基因组测序并获得完整拼接，但有关该菌的毒力因子及其致病机制和弱毒疫苗的开发却鲜有报道。这主要是柱状黄杆菌的特殊分类地位、培养特性，特别是在遗传操作上的异常困难所导致。柱状黄杆菌属于拟杆菌门，与变形菌门中高效的遗传操作相比，拟杆菌门的许多病原菌导入外源基因困难、同源重组效率低，遗传改造难度大。因此，研究人员也推测了一些柱状黄杆菌可能的毒力因子，如：硫酸软骨素裂解酶(chondroitin lyase)、胶原酶(collagenase)和外膜蛋白A(OmpA)等，但并未找到它们与毒力相关的直接证据，仅检测了其表达水平(Laanto et al.,2014；Penttinenet al.,2016)。我们将这些经推测的可能的毒力蛋白，以及拟杆菌门其它病原菌中已报道的毒力因子，如：锌金属蛋白酶(zinc metalloprotease)和溶血素(hemolysin)等(Wexler,2007；Wiklund,2010；MillerScott,2021)，分别进行原核表达和纯化，与鱼类细胞共孵育，也并未观察到明显的细胞病变。

鉴于从拟杆菌门现有的研究资料难以筛选到柱状黄杆菌毒力因子的情况，本发明通过深入分析62株已报道的柱状黄杆菌全基因组序列，并结合该菌感染鱼体的特征，从数十个柱状黄杆菌胞外蛋白中进行与该菌毒力相关的蛋白的研究，最终获得一个与柱状黄杆菌毒力相关的基因。

参考文献：

农业部渔业渔政管理局.《中国水生动物卫生状况报告》.中国农业出版社,2014.Declercq AM,Haesebrouck F,Van den Broeck W,Bossier P,DecostereA.Columnaris disease in fish:a review with emphasis on bacterium-hostinteractions.Vet Res 2013,44(1),27.