[发明专利]一种基于液液萃取检测尿液中23种农药代谢物的方法

权利要求书

1.一种基于液液萃取同时检测尿中23种农药代谢物的UPLC-MS/MS方法，其特征在于，使用液液萃取对1mL尿液样品进行前处理，采用UPLC-MS/MS检测，其中液相色谱分离采用甲酸水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，质谱分析采用电喷雾多离子反应监测(MRM)正负模式同时扫描，采用质谱同位素内标法进行定量，通过配制待测物标准工作液建立校准曲线，定性定量同时检测23种农药代谢物，包含4种有机磷类杀虫剂代谢物、3种拟除虫菊酯类杀虫剂代谢物、10种新烟碱类杀虫剂代谢物、3种苯氧羧酸类除草剂代谢物、1种灭草松代谢物、以及2种多菌灵代谢物；所述的23种农药代谢物为：2-异丙基-6-甲基-4-嘧啶醇，2-[(二甲氧基磷硫酰基)磺酰]琥珀酸，对硝基苯酚，3,5,6-三氯-2-吡啶酚，3-苯氧基苯甲酸，4-氟-3-苯氧基-苯甲酸甲酯，反式-3-(2,2-二氯乙烯基)-2,2-二甲基环丙烷羧酸，啶虫脒，去甲基-啶虫脒，噻虫胺，去甲基-噻虫胺，呋虫胺，吡虫啉，吡虫啉-烯烃，5-羟基-吡虫啉，噻虫嗪，去甲基-噻虫嗪，2,4-二氯苯氧乙酸，2,4,5-三氯苯氧乙酸，2-甲,4-氯苯氧乙酸，灭草松，多菌灵，5-羟基甲苯咪唑；根据离子对和出峰时间对待测物进行定性，利用内标法及根据峰面积对待测物进行定量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对尿液样品前处理方法包括以下步骤：

步骤一、酶解：室温解冻尿样，涡旋混匀，加入水解酶以催化葡萄糖醛酸结合物发生水解反应并生成相应的游离态化合物；

步骤二、萃取：加入有机溶剂作为萃取剂以提取样本中待测分析物，并重复该萃取步骤以提高待测物的萃取效率；

步骤三、氮吹：将提取液进行氮吹后，并加入一定量的重悬液进行重悬，获得待测样品，以待下一步上机检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中所述的加入水解酶以催化葡萄糖醛酸结合物发生水解反应并生成相应的游离态化合物的具体方法是：用LC-MS grade水做流程空白。使用校准合格的移液器，取1mL尿样加入15mL聚乙烯离心管中，然后加入100μL(850单位)的β葡萄糖醛酸苷酶/硫酸酯酶溶液和100μg/L的同位素混合内标标准液10μL(含每个同位素内标1ng)，将混合液转入恒温摇床后，37℃孵育过夜16h，次日上午将混合液取出，混匀后短暂离心。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中所述的加入有机溶剂作为萃取剂以提取样本中待测分析物，并重复该萃取步骤以提高待测物的萃取效率的具体方法是：向上述15mL聚丙烯离心管中加入3mL乙酸乙酯/叔丁基甲醚(体积比5:1)萃取剂；用多通道涡旋振荡器震荡混匀15min，然后以转速3000g离心10min；用洁净的玻璃巴斯德吸管将上清液转移至洁净的15mL玻璃氮吹管中；向15mL聚丙烯离心管中的剩余残液再加入相同体积的萃取剂重复该萃取步骤以提高待测物的萃取效率；收集两次上清液于上述的15mL玻璃氮吹管中。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中所述的将提取液进行氮吹后，并加入一定量的重悬液进行重悬，获得待测样品的具体方法是：将两次收集的上清液置于玻璃氮吹仪中，35℃氮吹50min。待玻璃管中的液体吹至近干时，取出玻璃管并加入重悬液水：乙腈(7:3)500μL。涡旋两次后，将液体过滤并转移至棕色进样瓶中，获得待测样本，-20℃保存备用。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用超高效液相色谱将待测物与尿液基质分离，使用HSS T3色谱柱，以甲酸水溶液和乙腈分别为流动相A相和B相；采用梯度洗脱方式对待测物进行分离所述的液相色谱的具体条件为：使用2.1mm×150mm的ACQUITY HSS T3色谱柱，以0.05％甲酸水溶液和乙腈分别为流动相A相和B相，设置流动相流速为0.30mL/min，进样体积为10μL；色谱柱工作温度设置为40℃；采用梯度洗脱方式对待测物进行分离，流动相梯度洗脱程序设置为：0.0—1.0min，98％—96％的A相；1.0—9.0min，梯度96％—1％的A相；9.0—11.4min，维持1％的A相；11.5—14.5min，维持98％的A相，总分析时长为14.5min。