[发明专利]上游调控因子IbEBF2及其在调控紫心甘薯IbbHLH2表达中的应用

说明书

本发明公开了上游调控因子IbEBF2及其在调控紫心甘薯IbbHLH2表达中的应用。本发明以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbbHLH2的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，成功获得了IbbHLH2基因的上游调控因子IbEBF2。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbbHLH2启动子与上游调控因子IbEBF2之间存在相互作用。亚细胞定位结果显示，IbEBF2定位在细胞核。自激活活性实验结果表明，IbEBF2具有自激活活性。本发明在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。

技术领域

本发明涉及植物基因育种技术领域，具体涉及上游调控因子IbEBF2及其在调控紫心甘薯IbbHLH2表达中的应用。

背景技术

紫心甘薯是由日本培育成功的具有独特遗传性状的甘薯新品种，其块根中因含有十分丰富的花色素苷而呈深紫色。紫心甘薯植株的株型匍匐，蔓比较长，分枝位置偏中上，叶片呈现深绿色，须根较多，块茎膨大生长缓慢，而且富含蛋白质和多种氨基酸。与普通甘薯相比，硒、铁、磷等微量元素的含量高25～30％左右。亩产在1000～1500公斤，而且抗病性强，适应性广。此外，紫心甘薯最重要的性状是其块根中富含大量的花色素苷。

在对植物花色素苷的生物合成中，MYB蛋白通常与bHLH及WD40蛋白相互作用并形成三元复合体MBW产生协同作用进行调控。参与植物花色素苷合成酶基因转录表达调控的转录因子主要有三类：MYB、bHLH(也称MYC)和WD40。bHLH类转录因子具有保守的碱性-螺旋-环-螺旋结构域，是真核生物中广泛存在的一个较大的转录因子家族。典型的bHLH结构域在其N端包含约18个亲水性的碱性氨基酸，其后是两个由环隔开的亲水和亲脂性α螺旋。bHLH转录因子通过HLH区域形成同二聚体或异二聚体并与靶基因启动子的不同部位相结合，从而对基因的转录发挥调控作用。bHLH转录因子参与植物生长发育、信号转导和次生代谢等诸多生物学过程。其中调节类黄酮和花色素苷合成是植物bHLH转录因子最重要的功能之一。

前人的研究发现，bHLH类转录因子可以调节植物生长发育以及花色素苷的合成代谢。与花色素苷生物合成调控相关的bHLH转录因子基因，已经从大丽菊、玉米、拟南芥、牵牛以及甜橙等多种植物中分离获得。参与花色素苷合成调控的bHLH类转录因子家族成员，依据其进化特征可分为2类：bHLH1和bHLH2。然而，不同种属的植物中参与花色素苷调控的bHLH类转录因子家族成员有所不同，并且其对花色素苷合成的调控模式也存在差异。

在紫心甘薯中克隆获得了转录因子IbbHLH2的基因序列，IbbHLH2基因能够调控花色素苷合成途径中关键酶基因的表达，进而影响紫心甘薯中花色素苷的积累。进一步研究表明不同甘薯品种(系)及其根发育时期中，IbbHLH2基因的表达与花色素苷的合成积累是完全同步的，说明IbbHLH2是紫心甘薯花色素苷合成代谢中的关键转录调控因子。由于植物花色素苷的分子量较小，其化学结构的解析相对容易，同时不同的代谢产物可呈现不同的颜色，因此植物花色素苷合成的调控机制和信号传递过程已成为研究植物基因表达与调控以及基因与环境相互作用的理想系统。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于筛选一种促进紫心甘薯IbbHLH2转录因子表达的上游调控因子。

为了解决上述技术问题，本发明首先用Trizol法从甘薯块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA，构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库。

进一步的，以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbbHLH2的启动子DNA片段，并将启动子IbbHLH2构建到pAbAi载体中，扩增IbbHLH2的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：

PIbbHLH2-F：5'-TCCTAGCCAAGAAGAGTGGAGAGA-3'和