[发明专利]DNA甲基化测序文库及制备方法和DNA甲基化检测方法

权利要求书

1.一种DNA甲基化测序文库的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)、获得3’末端缺失的双链DNA；

(2)、采用全甲基化的dNTP对所述3’末端缺失的双链DNA进行末端修复，以形成具有平末端的双链DNA，并在所述平末端的双链DNA的两个末端添加接头序列，得到接头连接产物；

(3)、采用甲基化保护试剂将所述接头连接产物的双链DNA的甲基化胞嘧啶氧化为受保护胞嘧啶，得到甲基化保护产物；

(4)、将所述甲基化保护产物中的双链DNA变性为单链DNA；

(5)、采用转化试剂将所述单链DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，得到转化后单链DNA；

(6)、对所述转化后单链DNA进行PCR扩增，得到DNA甲基化测序文库。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述3’末端缺失的双链DNA为ctDNA。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述3’末端缺失的双链DNA为血液中游离的cfDNA。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述cfDNA的长度位于170至210bp之间，或者为170至210bp之间的任意一个数的整数倍；和/或，

所述3’末端缺失的双链DNA的每条链的3’端存在1至80个碱基的缺失。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述甲基化保护试剂包括TET2蛋白和氧化增强剂；

所述甲基化胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶；

所述受保护胞嘧啶为5-甲酰胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述变性的温度为50±5℃，添加的变性剂为碱液。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述转化试剂包括APOBEC蛋白。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述PCR扩增在PCR扩增体系中进行，所述PCR扩增体系包括20μL的转化后单链DNA、5μL的EM-seq Index Primerplate和25μL的NEBNext Q5U Master Mix；所述PCR扩增的反应条件为：先在98℃时运行30s；然后在98℃时持续10s，62℃时持续30s，64℃时持续60s，一共持续9个循环；接着在65℃时持续5min，最后在4℃时保存。

9.一种DNA甲基化测序文库，其特征在于，所述DNA甲基化测序文库由如权利要求1至8中任意一项所述的制备方法构建而成。

10.一种DNA甲基化水平的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

对3’末端缺失的双链DNA按照权利要求1至8任意一项所述的制备方法构建DNA甲基化测序文库；

采用测序仪对所述DNA甲基化测序文库进行测序，得到测序结果；

从所述测序结果中去除所述DNA甲基化测序文库中3’末端修复后的全甲基化的dNTP信息，得到DNA甲基化水平。