[发明专利]用于合成依克多因的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体

说明书

本发明公开了一种二氨基丁酸乙酰转移酶突变体SEQ ID NO:3，该二氨基丁酸乙酰转移酶突变体能够高效地催化L‑2,4‑二氨基丁酸反应生成N‑乙酰‑2,4‑二氨基丁酸，进一步在ectC酶催化下生成依克多因。

技术领域

本发明属于代谢工程领域，具体地说，涉及一种二氨基丁酸乙酰转移酶突变体、及其用于生产依克多因的用途。

背景技术

依克多因(Ectoin)，化学名为(S)-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸，又名四氢甲基嘧啶羧酸，简称四氢嘧啶，分子式为C₆H₁₀O₂N₂，是一种氨基酸衍生物，其结构式如下。

依克多因最初从嗜盐耐盐微生物中发现，其能使细胞在高盐、高渗透压、干燥、高温、强紫外辐射等环境下免受伤害。进一步研究发现，依克多因能够增强细胞或生物大分子的稳定性，从而进行自我修护。研究表明，依克多因同样对皮肤有很好的修复保护作用，可作为化妆品添加剂起到保湿、抗皱等作用，还可用于医疗保健，比如用于治疗应激性皮炎、神经性皮炎、肺炎、过敏性鼻炎、湿疹等疾病，极具市场潜力。

目前，Ectoin主要是以嗜盐菌发酵来制备。1998年，Sauer等人(Biotechnologyand Bioengineering,1998,57(3):306-313)利用高盐(15％～20％NaCl)培养基培养伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)，发酵120h后，利用微滤浓缩收集菌体并转入低盐(3％NaCl)培养基中释放胞内的依克多因。随后再收集菌体并利用高盐培养基发酵合成依克多因，循环9次后，依克多因的产量达到7.4g/L。2008年，Nagata等人(Biotechnology andBioengineering,2008,99(4):941-948)发现Brevibacterium sp.JCM 6894不仅能够合成依克多因，而且具备在高盐和低盐反复冲击下不易破裂的特点，但依克多因的产量仅为2.4g/L。但是，高盐发酵对生物反应器设备要求较高，不但影响设备的寿命，后续的废液处理也有很大的难度，导致依克多因价格居高不下，限制了它的应用。

发明内容

为了能够利用传统的基因工程菌通过发酵法实现依克多因的大规模生产，降低依克多因的生产成本，发明人对于伸长盐单胞菌中的依克多因合成途径进行了研究，发现在依克多因的生物合成途径中，二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)、二氨基丁乙酸转氨酶(EctB)和四氢嘧啶合酶(EctC)(简写ECT)的酶活力影响显著。其中，EctB用于催化L-天冬氨酸-β-半醛反应生成L-2,4-二氨基丁酸，EctA用于催化L-2,4-二氨基丁酸反应生成N-乙酰-2,4-二氨基丁酸，EctC用于催化N-乙酰-2,4-二氨基丁酸反应生成依克多因。发明人通过突变提高了EctA的酶活力，从而大幅度提高了产依克多因的细菌的依克多因产量，改进了发酵法合成依克多因的经济性。因此，本发明包含如下技术方案：

一种二氨基丁酸乙酰转移酶突变体，其为伸长盐单胞菌CGMCC 1.6329(Halomonaselongata CGMCC 1.6329)来源的野生型二氨基丁酸乙酰转移酶的氨基酸序列SEQ ID NO:2中下述位点的三个以上、优选四个以上、直至五个发生突变后所形成的突变体：T4、P17、P53、N162、D177，该二氨基丁酸乙酰转移酶突变体可催化L-2,4-二氨基丁酸反应生成N-乙酰-2,4-二氨基丁酸。

上述的术语“突变”包括但不限于氨基酸的取代、缺失或添加。

优选地，上述突变选自下组：T4A、P17H、P53T、N162H、D177V。

在一种优选的实施方式中，上述二氨基丁酸乙酰转移酶突变体为SEQ ID NO:2的(T4A、P17H、P53T、N162H、D177V)突变体，相对于SEQ ID NO:2而言，发生了5个位点的氨基酸替换，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：