[发明专利]一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域；本发明提供的里氏木霉cbh1基因启动子突变体，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本发明还提供了里氏木霉重组菌株，所述重组菌株中含有上述里氏木霉cbh1基因启动子突变体。本发明构建的里氏木霉cbh1基因启动子突变体可以提高驱动β‑甘露聚糖酶表达的效果，利用本发明的里氏木霉cbh1基因启动子突变体构建的β‑甘露聚糖酶表达菌株可以显著提高β‑甘露聚糖酶的产量。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用。

背景技术

丝状真菌具有强大的蛋白质合成分泌能力，广泛应用于工业酶的生产，在医药蛋白的生产中也具有良好的应用前景。里氏木霉(Trichoderma reesei)是生产纤维素酶的主要微生物，其胞外蛋白产量可达到80g/L以上，其中纤维二糖水解酶I约占60％-70％，这一高表达强度使该酶编码基因的启动子Pcbh1成为驱动里氏木霉中重组蛋白表达的首选。

里氏木霉中纤维素酶的表达受到多种转录因子的组合调控。其中，XYR1是关键的转录激活因子，而碳分解代谢物阻遏因子CRE1具有显著的负调控作用。此外，转录因子ACE2、ACE3和HAP2/3/5复合物对cbh1的表达具有正调控作用，而ACE1等转录因子对其表达有负调控作用。在cbh1基因启动子上，存在多个上述转录因子的结合位点。有研究将cbh1基因启动子中的转录激活因子结合位点进行优化，可以有效提高启动子的效率。此外，纤维素酶转录激活因子XYR1的氨基酸突变A824V可使其具有持续激活能力，使纤维素酶的表达摆脱对纤维素、乳糖等诱导物的依赖(Derntl et al.,Biotechnol Biofuels,2013,6(1):62)。

β-1,4-甘露聚糖是植物细胞壁的主要组分之一。β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)能够以内切的方式水解β-甘露聚糖中的糖苷键，释放出甘露寡糖等产物。β-甘露聚糖酶作为饲料添加剂，在畜禽和水产动物的养殖中有助于降解豆粕等饲料原料中的抗营养因子，促进动物生长，具有重要的应用价值。此外，β-甘露聚糖酶还可应用于食品工业中甘露寡糖的制备等。目前，β-甘露聚糖酶在里氏木霉表达宿主中的产量仍有待提升。

发明内容

本发明的目的是提供一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明构建的里氏木霉cbh1基因启动子突变体可以提高驱动β-甘露聚糖酶表达的效果，利用本发明的里氏木霉cbh1基因启动子突变体构建的β-甘露聚糖酶表达菌株可以显著提高其表达的β-甘露聚糖酶的产量。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体，所述启动子突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供上述的里氏木霉cbh1基因启动子突变体的构建方法，包括以下步骤：

将里氏木霉cbh1启动子核苷酸序列的-824bp至-774bp GGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAA替换为GGCTAAATGCGACATCTTAGCC；将核苷酸序列的-737bp的T替换为A；将核苷酸序列的-725bp至-686bp GTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCAC替换为GGCTAATTCCAACATCTTAGCC；将核苷酸序列的-532bp至-526bp GACATTC替换为GGCTAAG，设计合成所述里氏木霉cbh1基因启动子突变体。

本发明还提供上述的里氏木霉cbh1基因启动子突变体在构建β-甘露聚糖酶表达菌株中的应用。

进一步地，所述菌株为里氏木霉菌株。

进一步地，所述β-甘露聚糖酶为草酸青霉β-甘露聚糖酶。