[发明专利]一种检测ATP的荧光比率传感器及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种检测ATP的荧光比率传感器，其特征在于，所述荧光比率传感器的结构中包括单根硅纳米线，包裹在所述单根硅纳米线表面的异硫氰酸荧光素@SiO₂壳层，以及修饰在壳层表面的罗丹明B二亚乙基三胺荧光分子；

所述异硫氰酸荧光素@SiO₂壳层包裹在所述单根硅纳米线表面是通过如下方法获得的：将羟基化硅纳米线分散在水溶液中，加入异硫氰酸荧光素-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯，避光搅拌，减压抽滤，得到表面包裹异硫氰酸荧光素@SiO₂壳层的硅纳米线。

2.根据权利要求1所述的荧光比率传感器，其特征在于，所述修饰为通过共价键结合。

3.根据权利要求1所述的荧光比率传感器，其特征在于，所述单根硅纳米线的直径为100-300nm，长度为60-70μm。

4.如权利要求1-3任一项所述检测ATP的荧光比率传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将羟基化硅纳米线分散在水溶液中，加入异硫氰酸荧光素-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯，避光搅拌，减压抽滤，得到表面包裹异硫氰酸荧光素@SiO₂壳层的硅纳米线；

（2）将步骤（1）获得的硅纳米线进行羧基功能化处理，然后通过共价键结合的方式修饰罗丹明B二亚乙基三胺，得到所述检测ATP的荧光比率传感器。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述羟基化硅纳米线的制备包括如下步骤：制备硅纳米线阵列，对其表面进行羟基化处理，随后将单根硅纳米线从硅纳米线阵列上剥离，得到羟基化硅纳米线；

所述硅纳米线阵列通过银离子辅助化学刻蚀法制备；

所述羟基化处理是将硅纳米线阵列浸泡在浓硫酸和双氧水混合溶液中，加热回流，清洗干净后，浸泡在水、氨水和30%双氧水的混合溶液中，清洗干净后，干燥得到羟基化的硅纳米线阵列。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述羧基功能化处理是将步骤（1）获得的硅纳米线分散在PBS缓冲溶液中，加入羧基乙基硅烷三醇钠溶液，避光搅拌，减压抽滤，得到羧基功能化处理的表面包裹异硫氰酸荧光素@SiO₂壳层的硅纳米线；

所述通过共价键结合的方式修饰罗丹明B二亚乙基三胺是将羧基功能化处理的表面包裹异硫氰酸荧光素@SiO₂壳层的硅纳米线分散在水溶液中，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐溶液，预活化，然后加入罗丹明B二亚乙基三胺，避光反应，得到所述检测ATP的荧光比率传感器。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素-氨丙基三乙氧基硅烷是将异硫氰酸荧光素溶解在乙醇溶液中，加入氨丙基三乙氧基硅烷，避光搅拌，得到异硫氰酸荧光素-氨丙基三乙氧基硅烷。

8.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述罗丹明B二亚乙基三胺是将罗丹明B溶解在乙醇溶液中，加入二亚乙基三胺，80-90℃剧烈回流，得到罗丹明B二亚乙基三胺。

9.如权利要求1-3任一所述的荧光比率传感器或如权利要求4-8任一所述的制备方法制备得到的荧光比率传感器在检测单细胞内ATP浓度中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括单细胞内不同位点ATP浓度的同步检测。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，在进行单细胞内不同位点ATP浓度检测时，包括如下步骤：

（1）将所述荧光比率传感器置于不同ATP浓度的环境中，利用共聚焦荧光显微镜成像，获得不同ATP浓度下的荧光比率值，以ATP浓度为横坐标，以荧光比率值为纵坐标建立荧光比率值随ATP浓度变化的体外标准曲线，其中，荧光比率值=橙色荧光强度/绿色荧光强度；

（2）将所述荧光比率传感器与细胞共孵育，利用共聚焦荧光显微镜成像，获得单细胞内细胞核和细胞质区域的荧光比率值；

（3）根据体外标准曲线和步骤（2）获得的荧光比率值得到单细胞内细胞核和细胞质区域的ATP浓度。