[发明专利]一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法，属于生物检测领域。其中提供的检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物包括基于白纹伊蚊的COI基因序列设计的五条特异性LAMP引物，能够在20min内实现对白纹伊蚊的高灵敏度和高特异性检测。本发明还提供用于检测白纹伊蚊的环介导等温扩增试剂盒和检测方法。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法。

背景技术

白纹伊蚊(Aedes albopictus)，属于双翅目蚊科，是一种攻击性很强的蚊子，刺叮凶猛异常，刺叮后皮肤奇痒、可引起皮肤红肿，局部皮炎，甚至全身性皮炎，抓破后易溃痒感染。除刺叮骚扰外，白纹伊蚊还可以传播很多病原体，包括登革病毒、罗斯河病毒、西尼罗病毒等。因此，防控白纹伊蚊的传播对防控以上多种病原体的传播至关重要，而在白纹伊蚊的防控中需要对白纹伊蚊进行鉴别检测。

目前，对白纹伊蚊的鉴别方法主要通过医学媒介生物的传统形态鉴定方法，其存在很多问题，例如受发育状态、肢体残缺不全的限制、近缘种等难以准确鉴定，以及输入性医学媒介生物由于缺少参考资料和参比标本也无法准确快速鉴定；另外还存在鉴定周期长、鉴定人员技术水平要求高、费时费力等缺陷。

专利文献CN111534603A(以下称文献1)公开一种利用荧光RPA鉴定白纹伊蚊的方法，其基于荧光RPA检测的原理选择白纹伊蚊特异性序列第二内转录间隔区ITS2为靶基因设计了白纹伊蚊检测特异性引物和探针，相对于传统的形态鉴定方法可以不受白纹伊蚊的发育状态、肢体残缺不全、近缘种、缺少参考资料和参比标本等原因的限制，能够实现对白纹伊蚊目的DNA的检测限为0.01ng/μL，并且25min即可完成检测，表现出较佳的检测灵敏度和检测效率。然而，该文献1方法在检测白纹伊蚊的检测灵敏度方面仍存在不足。

发明内容

针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物，其包括：

包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的正向内引物FIP，

包含如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的反向内引物BIP，

包含如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的正向外引物F3，

包含如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的反向外引物B3，和

包含如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向环引物LB。

本发明另一方面提供一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增试剂盒，其包括上述的环介导等温扩增引物。

在一些实施方式中，上述试剂盒还包括用于环介导等温扩增检测白纹伊蚊的反应体系的反应缓冲液、荧光染料、DNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺。

在一些实施方式中，上述试剂盒还包括用于环介导等温扩增检测白纹伊蚊的反应体系的Bst4.0 SYBR Green IsoAmp MasterMix，其包含反应缓冲液、SYBR Green荧光染料、Bst4.0DNA/RNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺。

本发明又一方面还提供一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增方法，其包括以下步骤：

1)提取待测样品DNA；

2)利用上述的环介导等温扩增试剂盒对步骤1)提取的待测样品DNA进行环介导等温扩增，读取扩增曲线；

3)根据步骤2)读取的扩增曲线进行结果判定：

若阳性对照出现扩增曲线且循环数Ct≤35，且阴性对照不出现扩增曲线或出现扩增曲线的循环数Ct35，则证明试验结果有效；