[发明专利]一种原代汗腺细胞体外分离方法

说明书

本发明提供了一种原代汗腺细胞体外分离方法，其中，所述原代汗腺细胞体外分离方法包括：采用胶原蛋白包被细胞培养皿，获得包被细胞培养皿；向所述包被细胞培养皿内加入汗腺条件培养基，将汗腺组织加入所述包被细胞培养皿中；待汗腺组织贴壁并爬出细胞后，使用差速消化法实现原代汗腺细胞的体外高度富集。本发明利用胶原蛋白包被细胞培养皿以增加贴壁细胞的粘附性，使得90％的离体汗腺组织可以在8小时内快速贴壁，并在24小时内爬出汗腺细胞。本发明所提供的改良方法避免了传统酶消化法中涉及的二次组织消化、高强度机械吹打、及离心对细胞造成的伤害，简化了分离步骤，提高了原代汗腺的分离效率，有利于原代汗腺细胞的活性维持及其体外扩增。

技术领域

本发明涉及汗腺细胞培养技术领域，特别是涉及一种高效实现原代汗腺细胞体外快速富集的原代汗腺细胞体外培养分离方法。

背景技术

汗腺是皮肤最为重要的附属器官之一，在物质代谢、水电解质平衡以及维持机体内环境稳态等方面具有举足轻重的作用。然而汗腺的再生能力有限，且创伤后皮肤的瘢痕性修复进一步破坏了汗腺的结构和功能，导致皮肤不能正常排汗，体温调节失衡，给患者带来巨大生理及心理伤害。

随着皮肤创伤修复研究的不断深入，以干细胞技术为核心的再生医学被誉为“继药物治疗和手术治疗之后的一个医疗革命”，为大面积深度烧创伤患者的康复治疗，恢复其排汗功能带来了新的契机。由于创面内残余汗腺细胞数量不足、机能有限，自体或同种异体汗腺移植成为一种替代性方法，开始应用于创皮肤功能性修复相关的基础与临床研究中。目前，人原代汗腺的分离手段尚不成熟。且现有技术主要采用组织块培养法，分离周期长、获取的汗腺细胞少、且种类不纯，无法满足临床治疗中对细胞“数量”及“质量”的要求。因此，改良原有技术手段，探索一种高效制备可治疗用汗腺细胞的体外分离方法势在必行。

发明内容

本发明实施例提供了一种原代汗腺细胞体外分离方法，以解决现有技术无法实现原代汗腺细胞的体外快速富集的问题。

为了解决上述问题，本申请是这样实现的：

本发明实施例提供了一种改良的原代汗腺细胞体外分离方法，其中，包括：

采用胶原蛋白包被细胞培养皿，获得包被细胞培养皿；

向所述包被细胞培养皿中加入汗腺条件培养基，将汗腺组织加入所述包被细胞培养皿中；

待汗腺组织贴壁并爬出汗腺细胞后，使用细胞消化液消化汗腺细胞，并在消化终止后，移入新的包被细胞培养皿中，完成传代培养。

可选地，所述的方法中，采用胶原蛋白包被细胞培养皿，包括：

向细胞培养皿加入胶原蛋白，然后置于CO₂培养箱中进行包被处理后吸掉胶原蛋白，并用磷酸缓冲盐溶液清洗，完成细胞培养皿的包被。

可选地，所述的方法中，所述胶原蛋白为IV型胶原蛋白。

可选地，所述的方法中，在使用细胞消化液消化汗腺细胞的过程中，在加入所述细胞消化液后，当观察到汗腺细胞漂浮时加入所述汗腺条件培养基终止消化。

可选地，所述的方法中，CO₂培养箱的温度为37℃、CO₂的体积分数为5％。

可选地，所述的方法中，所述方法还包括步骤：

在观察到成纤维细胞生长汇合度达到80％的情况下，用细胞消化液去掉成纤维，以纯化汗腺细胞。

可选地，所述的方法中，用细胞消化液去掉成纤维的步骤，包括：

取出细胞培养皿，用PBS清洗，再加入细胞消化液；

在加入细胞消化液后，当观察到汗腺周围的成纤维细胞漂浮时加入所述汗腺条件培养基终止消化；