[发明专利]一种测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法

说明书

一种测定灵芝中β‑葡聚糖含量的方法，其特征在于：制作测定样品，以无水葡萄糖为对照品，使用蒽酮‑硫酸法测定样品中β‑葡聚糖含量，所述的测定样品的制作方法为：使用高温高压提取‑加压过滤‑复合酶解‑超滤离心净化而得到。本发明制作测定样品的方法速度快，能不间断连续地完成检测：使用高温高压加速提取；提取后使用压力逼出残渣吸附的提取液；通过复合酶解将α‑葡聚糖完全分解成单糖和寡糖；通过木瓜蛋白酶将水溶性蛋白和复合酶大部分分解成氨基酸和寡肽；单糖和寡糖，氨基酸和寡肽通过超滤离心除去；消除α‑葡聚糖对检测结果的干扰，测定结果更准确。

技术领域

本发明属于天然产物提取和分析化学领域，具体涉及一种测定灵芝中β-葡聚糖成分含量的方法。

背景技术

灵芝(GanodermaLucidum(Leyss ex Fr.)Karst.)为担子菌门多孔菌科灵芝属真菌赤芝的干燥子实体，灵芝孢子粉(GanodermaLucidumspore)为赤芝的生殖细胞，二者都含有以灵芝三萜、灵芝多糖、灵芝核苷类和灵芝甾醇类为主的活性成分，具有调节免疫、抗肿瘤和保肝等活性。目前已从赤芝和孢子粉中分离到超过200种的灵芝多糖，大部分是以葡萄糖、半乳糖和甘露糖等单糖组成的杂多糖，其中主要的活性多糖是β-葡聚糖，它在调节免疫和抗肿瘤方面发挥着重要作用；而它的异构体α-葡聚糖不具备药理活性。

目前，灵芝多糖的测定方法常用的有中国药典2020版的蒽酮-硫酸法、NYT 1676食用菌中粗多糖含量的测定的苯酚-硫酸法和白鸿的《保健食品功效成分检测方法》的多糖检测方法，前两者都不能排除的α-葡聚糖的干扰，白鸿虽然强调用酶解排除对α-葡聚糖的干扰，但对酶的活性和使用条件上的描述较为模糊，也未对α-葡聚糖的干扰进行定量分析。β-葡聚糖的测定方法主要有酶法试剂盒的酶解检测法、蛋白特异性识别方法和化学检测法、苯胺蓝荧光检测法和刚果红法。酶法试剂盒步骤繁琐，虽然扣除了α-葡聚糖及其单糖寡糖，但不能排除膳食纤维的干扰；蛋白特异性识别法易受葡聚糖分子量和分支度等结构特征的影响，也易受水溶性蛋白质干扰；荧光法由于受到需要荧光检测器的仪器条件限制，不能广泛应用。刚果红法反应条件苛刻，易受到待测液中杂质干扰，对真菌类β-D-(1→3)和β-D-(1→6)葡聚糖特异性不强。

蒽酮-硫酸法是测定多糖含量的较为常用的方法，其原理为多糖类在浓硫酸作用下先水解为单糖分子，并迅速脱水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物再与蒽酮结合成带紫外吸收的络合物，其络合物较苯酚-硫酸法稳定，反应体系对操作人员友好，无需在通风橱操作，对环境要求低，无需水浴加热，适用于大部分配备有紫外可见光分光光度计的试验室，易于推广，灵芝β-葡聚糖经水解后产生的单糖有90％为葡萄糖。以无水葡萄糖为对照品可较为准确对灵芝β-葡聚糖进行定量。

目前主流的灵芝多糖检测方法为中国药典2020版的蒽酮-硫酸法，其中测定样品制作为：将2g灵芝或灵芝孢子粉加水60mL，静置1h，100℃加热回流4h，趁热过滤，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60mL，100℃加热回流3h，趁热滤过，需过滤0.5-1h，合并滤液，置水浴锅上蒸干，约需4h，残渣用水溶解，醇沉，在4℃放置12h，离心，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移至容量瓶定容50mL，取3mL定容25mL，即得供试品溶液。该法总共耗时1+4+3+0.5+4+12＝23.5工时，共计3天完成检测，操作繁琐，耗时耗力；并且该法将灵芝多糖中没有药理活性的α-葡聚糖也计入结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能较为准确测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种测定灵芝中β-葡聚糖含量的方法，其特征在于：制作测定样品，以无水葡萄糖为对照品，使用蒽酮-硫酸法测定样品中β-葡聚糖含量，所述的测定样品的制作方法为：使用高温高压提取-加压过滤-复合酶解-超滤离心净化而得到。