[发明专利]一种抗菌脂肽LP21的制备及其在治疗细菌感染中的应用

权利要求书

1.一种抗菌脂肽LP21，其特征在于，所述抗菌脂肽LP21从N端到C端的序列为C₈H₁₅O-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Trp-Trp-Leu-Lys-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Asp(简写为C₈H₁₅O-WKKLLKWWLKKFKKLD)，其中Trp为色氨酸，Lys为赖氨酸，Leu为亮氨酸，Phe为苯丙氨酸，Asp为天冬氨酸，所接脂肪酸为正辛酸C₈H₁₆O₂。抗菌脂肽结构式如下图所示：

2.根据权利要求1的一种抗菌脂肽LP21，其特征在于，其制备方法如下：

(1)Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Lys-(Boc)Leu-Asp(OtBu)-2-chlorotritylchloride resin的合成：采用固相合成法，从抗菌脂肽的C端到N端依次偶联氨基酸，称取一定量的Fmoc-Asp(OtBu)-2-chlorotrityl chloride resin(负载量：0.402mmol/g)与DMF混合以溶胀30min，其中Fmoc为Asp的氨基保护基团，OtBu为Asp侧链上的羧基保护基团，2-chlorotrityl chloride resin接在Asp的另一个羧基上；溶胀完成后，用含有20％哌啶的DMF溶液除去Fmoc保护基，然后依次用DMF，DCM和DMF洗涤三次，若茚三酮法检测呈蓝黑色，则说明脱Fmoc保护反应进行完全；用无水DMF重新溶胀上述脱Fmoc保护的树脂15分钟，然后加入2倍摩尔量的第二个氨基酸Fmoc-Leu-OH，2.6倍摩尔量的HOBT、DCC和DIEA，搅拌反应48h后，若茚三酮法检测无色，则说明偶联反应完全；抽滤树脂并依次用DMF，DCM和DMF洗涤多次，装于透析袋(MW 8000-14000)中，用乙醇透析纯化，抽滤，冷冻干燥获得Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-2-chlorotrityl chloride resin，重复上述步骤依次偶联剩余氨基酸，直至最终得到多肽树脂。

(2)C₈H₁₅O-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Trp-Trp-Leu-Lys-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Asp抗菌脂肽的合成：脱除(1)中得到的多肽树脂的Fmoc保护基，将2倍摩尔量的C₈H₁₆O₂与2.6倍摩尔量的EDC和NHS溶解于DMF中以活化C₈H₁₆O₂上的羧基基团，然后向上述DMF溶液中加入(1)中得到的多肽树脂，搅拌24h，抽滤，将树脂装于透析袋(MW 8000-14000)中，用乙醇透析纯化，抽滤，冷冻干燥获得带有侧链保护基的脂肽树脂；使用切割液(TFA：Tis：H₂O＝95：2.5：2.5)切割脂肽树脂所有的侧链保护基和树脂1.5h，过滤除去树脂，将切割液浓缩，冰乙醚沉淀并洗涤多次，最后通过冷冻干燥获得抗菌脂肽C₈H₁₅O-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Trp-Trp-Leu-Lys-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Asp。

3.根据权利要求1的一种抗菌脂肽LP21，其特征在于，采用微量肉汤稀释法对制备得到的抗菌脂肽进行体外抗菌活性检测，结果表明，本发明抗菌脂肽具有优异的体外抗菌活性；使用圆二色光谱测定抗菌脂肽的二级结构，结果表明，所述抗菌脂肽在膜模拟环境下表现α-螺旋结构；对制备得到的抗菌脂肽进行血清稳定性、生物相容性研究，结果表明，该抗菌脂肽具有良好的稳定性及生物相容性；研究所述抗菌脂肽的抗菌机理，结果表明，该抗菌脂肽具有较强的破膜机制；体内实验表明，抗菌脂肽具有良好的体内抗菌活性，可应用于制备治疗细菌感染的药物。