[发明专利]骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法及制得的组织工程皮肤在修复皮肤缺损中的用途

权利要求书

1.一种骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a.将脱细胞真皮放入细胞培养板上，加入完全培养基浸泡18-24h，置于37℃培养箱中孵育 1-2h；

b.将处于对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞用 0.25％胰蛋白酶液消化，消化3-5min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1200-1500rpm/min离心5-8min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞，在37℃孵育 36-60h，1200-1500rpm/min离心5-8min，弃上清，再次重悬细胞；

c按细胞密度10³-10⁵/孔将步骤b中获得的骨髓间充质干细胞接种于含有脱细胞真皮的细胞培养板中，置于 37℃，5％C0₂ ，95％湿度的无菌培养箱中培养，每隔2-3天换液一次，观察细胞成活及生长情况。

2.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法，其特征在于：步骤a中，脱细胞真皮的制备方法如下：人源真皮清洗消毒后，用低渗溶液反复浸泡清洗皮肤；将清洗后的皮肤用2-3mg/mL DispaseⅡ溶液处理过夜；将处理后的皮肤去除表皮，用生理盐水清洗；将获得的真皮用0.1-1mol/L Ca²⁺的高渗盐溶液处理18-36h；弃去高渗溶液用生理盐水清洗；将清洗后的真皮置于脱细胞液中，处理3-5h；最后将脱细胞真皮用生理盐水清洗。

3.根据权利要求2所述的一种骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法，其特征在于：所述脱细胞液包括以下成分：0.1-0.5％胰酶，0.5-1%SDS。

4.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法，其特征在于：步骤b中，所述骨髓间充质干细胞的分离培养方法如下：在无菌条件下用含有肝素抗凝剂的干细胞培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓悬液并用D-Hanks液稀释，在离心管加入Ficoll分离液，将稀释后的骨髓悬液缓慢加在Ficoll分离液上，1500-2000 rpm/min离心10-20分钟，收集富含有核细胞的界面层细胞并用D-Hanks液清洗，调整细胞浓度为 1×10⁴-10⁵/ml接种于的培养瓶，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下静置培养。

5.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法，其特征在于：步骤b中，所述骨髓间充质干细胞的传代方法如下：细胞长至瓶底的 80%-90%进行传代，用无菌 PBS 冲洗细胞后加入 0.25%胰蛋白酶液，消化1-2min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1200-1500rpm/min离心5-8min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞于培养瓶中，2-3 天传代一次。

6.一种权利要求1-5任一所述的骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法制备获得的组织工程皮肤。

7.一种权利要求6所述的组织工程皮肤在修复皮肤缺损中的用途。