[发明专利]利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法

说明书

本发明公开了一种利用TPCK胰酶提高SARS‑CoV‑2病毒细胞培养滴度的方法，其特征在于将SARS‑CoV‑2病毒接种到细胞中，然后以含有TPCK胰酶的维持培养基进行培养，从而扩增SARS‑CoV‑2病毒，培养滴度得到大幅度提高，培养时间有效缩短。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法。

背景技术

冠状病毒是一类有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组27-32kb，在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，主要分为α、β、γ三个属。自然界中，冠状病毒宿主广泛，可感染多种禽类和哺乳动物。

在病毒学的发展史中，利用体外培养的动物组织、胚胎或细胞，分离培养病毒是突破性的成就，体外组织细胞培养是开展新病毒分离鉴定、致病机理研究、疫苗评价和药物研发等工作不可或缺的技术平台。据报道SARS-CoV-2可感染Vero E6和Huh-7细胞系，分离培养一代需要约4-6天的时间，培养时间长且细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)不易观察，必须借助PCR检测的方法才能确定病毒的存在。这不仅在一定程度上制约SARS-CoV-2分子生物学的研究发展，减缓了SARS-CoV-2疫苗和相关药物的研发速度，也潜在的增加了生物安全的风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供利用TPCK胰酶提高 SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法，SARS-CoV-2病毒在细胞中的培养滴度得到大幅度提高，培养时间有效缩短。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法，将SARS-CoV-2病毒接种到细胞中，然后以含有TPCK胰酶的维持培养基进行培养，从而扩增SARS-CoV-2病毒，收获病毒液，即为较高滴度的SARS-CoV-2病毒液。

按上述方案，所述维持培养基中TPCK胰酶的含量在0～16μg/mL，优选在0～4μ g/mL，且不为0。

按上述方案，所述维持培养基中还包括DMEM培养液、BSA、青-链霉素。优选地，维持培养基由DMEM、BSA、青-链霉素和TPCK胰酶组成，在DMEM基础培养基中添加了青霉素100μg/mL、链霉素100μg/mL、牛血清白蛋白(BSA)2.5mg/mL、TPCK胰酶0～ 4μg/mL。

按上述方案，接种的SARS-CoV-2病毒与接种细胞的数量比值(multiplicity ofinfection，MOI)在0.01～100之间，SARS-CoV-2病毒接种到细胞中1～2小时后，以含有TPCK胰酶的维持培养基进行培养1～3天。优选地，SARS-CoV-2病毒接种到细胞中1～2 小时后，以含有TPCK胰酶的维持培养基进行培养24～72小时。

按上述方案，本发明主要采用人肝癌细胞Huh7.5和非洲绿猴肾细胞Vero E6作为接种细胞。进一步地，接种细胞为初始细胞传代浓度为3×10⁴个/mL～5×10⁵个/mL的人肝癌细胞或非洲绿猴肾细胞，预先培养24～48小时后，接种SARS-CoV-2病毒。

本发明还提供一种优选地利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法，采用初始细胞传代浓度为3×10⁴个/mL～5×10⁵个/mL的人肝癌细胞或非洲绿猴肾细胞，培养24～48小时后，接种MOI＝10的SARS-CoV-2病毒，接种1-2小时后，用Hank's缓冲溶液等无菌洗液洗涤细胞，然后再以含有0～4μg/mL TPCK胰酶的维持培养基进行培养1-3 天，从而扩增SARS-CoV-2病毒来提高培养滴度。