[发明专利]表达非洲猪瘟病毒B602L-B646L蛋白的重组腺病毒及构建方法在审

申请号：	202111423263.X	申请日：	2021-11-26
公开（公告）号：	CN114107389A	公开（公告）日：	2022-03-01
发明（设计）人：	朱鸿飞;贾红;鑫婷;郭晓宇;袁维峰;崔帅;王洋	申请（专利权）人：	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
主分类号：	C12N15/861	分类号：	C12N15/861;C12N15/64;C12N15/34;A61K39/12;A61P31/20
代理公司：	北京东方盛凡知识产权代理事务所(普通合伙) 11562	代理人：	许佳
地址：	100193 ***	国省代码：	北京;11
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摘要：
搜索关键词：	表达非洲猪瘟病毒 b602l b646l 蛋白重组构建方法
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【权利要求书】：

1.一种表达非洲猪瘟病毒B602L-B646L蛋白的重组腺病毒载体，其特征在于，以pAD-CMV-3×FLAG腺病毒载体为基础，引入B602L-B646L基因以构建重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-B602L-B646L；所述B602L-B646L基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述的表达非洲猪瘟病毒B602L-B646L蛋白的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成B602L-B646L基因，并在B602L-B646L基因的起始密码子前添加CACC四个碱基；

(2)将步骤(1)得到的B602L-B646L基因和pENTRE-EGFP-TOPO载体进行TOPO克隆，得到pENTR-EGFP-ASFV-B602L-B646L；

(3)将步骤(2)得到的pENTR-EGFP-ASFV-B602L-B646L通过LR重组反应于腺病毒骨架载体pAD-CMV-3×FLAG进行重组，得到重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-B602L-B646L。

3.一种重组腺病毒包装方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-B602L-B646L用PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293t细胞，实现重组腺病毒包装。

4.根据权利要求3所述的重组腺病毒包装方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-B602L-B646L用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染AD293细胞；

(2)转染后至细胞脱落、变圆且间隙变大时，收集细胞及上清，即为P1代重组腺病毒；

(3)P1代重组腺病毒感染293t细胞，观察细胞状态。

5.根据权利要求4所述的重组腺病毒包装方法，其特征在于，所述转染AD293细胞采用的转染试剂为ietPRIME kit转染试剂。

6.根据权利要求4所述的重组腺病毒包装方法，其特征在于，在步骤(2)中，收集细胞及上清后，置于-80℃反复冻融3次，12000×g离心10min，收集上清。

7.权利要求3-6所述的重组腺病毒包装方法制备得到的重组腺病毒。