[发明专利]一种亮氨酸脱氢酶突变体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明将来源于微生物Exiguobacterium sibiricum的NADH依赖型亮氨酸脱氢酶(LeuDH)作为亲本，基于定点突变技术对酶结构进行改造，通过半理性设计的方法获得了催化活性提高的突变体K77S/N270L/L52S和K77S/N270L/T143C。相对于亲本无法催化戊酮，该突变体酶在25℃孵育条件下，对戊酮体现催化活性。本发明所述突变体使得难以催化的戊酮底物展现催化活性，具有更好的工业化应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是指一种亮氨酸脱氢酶突变体及其制备方法与应用。

背景技术

亮氨酸脱氧酶(Leucine dehydrogenase，LeuDH，EC1.4.1.9)是一种辅酶 NADH依赖型的氧化还原酶，它能将手性酮酸氢化还原生成对应的手性非天然氨基酸，并具有反应条件温和、产物光学纯和转化效率高等优点。1961 年，Sanwal等人最先在Bacillus cereus中克隆和表达了亮氨酸脱氧酶，随后，对不同菌株来源的亮氨酸脱氢酶基因进行克隆和异源表达，可以为一些手性非天然氨基酸的生物合成提供更多途径。亮氨酸脱氢酶是一种常见的氧化还原酶，来源广泛。来源不同的亮氨 酸脱氢酶具有不同的催化性质和功能，通过基因工程手段构建高酶活菌株可以改善反应。

然而，野生型亮氨酸脱氢酶目前难以催化脂肪族酮类。目前，蛋白质工程已成为帮助野生型酶克服自身局限性的重要手段；2012年，Abrahamson 等人以天然的Baillusstereothermophilus亮氨酸脱氢酶为模板，在酶活性口袋与天然底物羧基结合的两个关键位点K68和N261由亲水性残基突变为疏水性残基S68和L261之后，其催化的底物由脂肪族氨基酸改变为不含羧基的脂肪酮类化合物，创造出了非天然的胺脱氢酶(aminedehydrogenase， AmDH)。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其制备方法与应用。本发明提供了催化活性提高的亮氨酸脱氢酶突变体，所述突变体以来源于微生物Exiguobacterium sibiricum的亮氨酸脱氢酶(LeuDH)为亲本，对第52位、第77位、第270位突变，具体说，是将亲本中的Leu52 位的亮氨酸突变为丝氨酸Ser，Lys77位的赖氨酸突变为丝氨酸Ser，Asn270 位的天冬氨酸突变为亮氨酸Leu，获得三元突变体酶，命名为 K77S/N270L/L52S。对第143位、第77位、第270位突变，具体说，是将亲本中的Thr52位的苏氨酸突变为半胱氨酸Cys，Lys77位的赖氨酸突变为丝氨酸Ser，Asn270位的天冬氨酸突变为亮氨酸Leu，获得三元突变体酶，命名为K77S/N270L/T143C。

一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述突变体在氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示的亮氨酸脱氢酶为亲本，将所述亲本序列中第77位氨基酸突变为丝氨酸和第270位氨基酸突变为亮氨酸，将第52位和/或第143位氨基酸突变为除与自身同一生化特性类别氨基酸以外的其他任意氨基酸。

在本发明的一个实施例中，所述突变体在氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示的亮氨酸脱氢酶为亲本，将所述亲本序列中第77位氨基酸突变为丝氨酸和第270位氨基酸突变为亮氨酸，将第52位突变为丝氨酸和/或第143位氨基酸突变为半胱氨酸。

在本发明的一个实施例中，所述突变体酶突变体的氨基酸序列见SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5。

在本发明的一个实施例中，编码所述突变体酶突变体的核苷酸序列见 SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.6。

在本发明的一个实施例中，携带所述的表达载体的表达宿主为大肠杆菌 BL21(DE3)。

一种核酸，编码所述的亮氨酸脱氢酶突变体。

一种重组载体，携带所述的核酸。