[发明专利]一种南极磷虾组织蛋白酶及其异源表达方法

权利要求书

1.一种南极磷虾组织蛋白酶，其特征在于所述酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种南极磷虾组织蛋白酶，其特征在于所述组织蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述组织蛋白酶的制备方法，其特征在于所述方法具体如下：

（1）以PET-28a空载为载体骨架，构建片段序列：NcoI--ATG--sfGFP-15--3C--南极磷虾组织蛋白酶CLP--Xho1--His tag--Stop codon；

（2）将PET28a-sfGFP-3c-CLP质粒转入BL21(DE3)，放入37℃培养箱24h后，用蓝光仪照射菌板，观察菌落是否有荧光；

（3）挑取3-5个有荧光单菌落接入10ml的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8，取各1ml菌液分别500 μ l 保菌和500 μ l 离心弃上清留菌体，制作上样样品留最后进行SDS-PAGE分析，剩下加入终浓度为1mM的IPTG，18℃诱导16-18 h；

（4）取诱导后菌液500 μ l ，离心弃上清留菌体，制作上样样品进行SDS-PAGE分析；

（5）挑取蓝光仪照射有荧光的单菌落接入10ml的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8，取菌液接入1L LB液体培养基进行转接，37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，18℃诱导16-18 h，收集菌体；

（6）用破菌buffer 清洗菌体，再重悬菌体，加入体积比1%的PMSF，置于冰上超声破菌，功率300-400w，超声处理2s间隔4s，破菌至重悬菌液澄清透光，液体无混沌状；

（7）向破菌后的液体中加入千分之一体积的PMSF，离心，将上清收集至离心管，加入终浓度为10mM的咪唑，0.45μm滤膜过滤，4℃待用；

（8）用破菌buffer平衡Ni-NTA珠的纯化柱：3倍珠体积破菌buffer洗2次，再用3倍珠体积含有10mM咪唑的破菌buffer洗1次；

（9）将上清取样后加入柱中，于4℃用静音混合器孵育1-2h；沉淀加水或buffer重悬，取样，制作SDS-PAGE分析上样样品；

（10）垂直静置至珠子平铺于底部，打开盖子使柱内液体在重力作用下流出，收集流穿液取样；依次用含有不同浓度咪唑的破菌buffer洗脱,分别单独收集这些洗脱液，静置3-5分钟后收集溶液，取样，制作上样样品进行SDS-PAGE分析；

（11）收集目的蛋白较纯的梯度，用超滤管浓缩，用储存buffer超滤换液去除咪唑；

（12）检测浓缩蛋白液的纯度，进一步使用分子筛除杂，加入终浓度为10%-20%的甘油冻存于-80℃。