[发明专利]用于快速鉴定唾液乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了用于快速鉴定唾液乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用，属于快速检测领域。该特异性引物对包括：其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。利用该引物能快速精准的进行唾液乳杆菌的鉴定。同时，应用该引物对进行了口腔护理产品中唾液乳杆菌的鉴定，并探索出了该方法在漱口水的最低检出限为0.00001％(10³CFU/g)，灵敏度高，检测效率高。

技术领域

本发明涉及快速检测技术领域，特别是用于快速鉴定唾液乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用。

背景技术

口腔是一个复杂而完整的微生态系统。生活方式、外源性致病菌等外源因子可扰乱口腔微生物组与其宿主之间的共生关系引发龋齿,牙周炎,牙龈炎,口臭等口腔疾病。益生菌是一类活的并对人类机体局部或全身性健康都具有有益作用的微生物。近十年,各种研究表明益生菌可通过抑制致病菌生长,改善口腔微生物菌群,调节口腔免疫力等方式对各种口腔疾病产生积极的防治效果，作为一种新兴的机体健康维护概念,维护口腔健康的益生菌及其作用机制日益受到国内外学者的密切关注。

唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，革兰氏染色阳性，不生成孢子，不具触酶、氧化酶及运动性，在好氧及厌氧环境均能生长，属于兼性异质发酸性菌株，葡糖代谢时不产生气体。属于有益菌种，可以促进胃液分泌，帮助肠道蠕动，有助于提高机体的消化能力，还能减少血清中的特异性IgE抗体生成，刺激免疫细胞分泌抗过敏的物质，提高人体的免疫力。可达到改善过敏体质的效果，对口腔致病菌比如变异链球菌有一定的抑制作用。

益生菌的检测对于新食品及日化原料、新食品研制和生产、以及后续产品的质量安全控制来说意义重大。现有的传统检测方法仅限于乳酸菌总数和少数几种益生菌，如GB4789.35-2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》，GB 4789.34-2016《食品微生物学检验双歧杆菌检验》中公开的检测方法。唾液乳杆菌与副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的亲缘关系非常接近，很难利用传统的发酵特性来区分它们。同时，口腔护理产品中唾液乳杆菌的添加需基于法规对于菌落数的限量要求，添加的唾液乳杆菌是灭活菌株，也无法通过传统的生化鉴定进行鉴别，因此，对于唾液乳杆菌的分子鉴定显得尤为必要。目前分子学方法主要采用扩增16S保守序列片段，再根据测序结果与NCBI数据库中基因序列进行比对，通过构建系统发育树来确定其亲缘关系与种属，同时也要结合传统生化鉴定才能最终确认。故亟待开发一种快速鉴定唾液乳杆菌的种特异性引物鉴别方法。目前暂无搜索到唾液乳杆菌种特异性引物鉴别的相关专利，也未搜索到相关文献报道。

唾液乳杆菌目前主要是通过形态学、生理生化鉴定、16S rDNA基因序列测定及同源性分析结合来进行鉴别，但用于口腔护理产品中的唾液乳杆菌是灭活菌株，无法通过传统生化鉴定进行确认，同时16s rDNA基因序列测序分析不仅耗时麻烦，而且对于相似度很高的近缘菌株也无法分辨到具体的种。

发明内容

本发明目的在于解决上述技术问题，提供本发明提供了于快速鉴定唾液乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用，利用该引物能快速精准的进行唾液乳杆菌的鉴定。同时，应用该引物对探究了口腔护理产品中唾液乳杆菌鉴定的DNA提取方法，灵敏度高。

为了达到上述目的，本发明的技术方案有：

本发明提供了用于快速鉴定唾液乳杆菌的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，即：5’-TTATCTGAATACGACTTCCCTG-3’；其下游引物核苷酸序列如SEQID NO:2所示，即：5’-GTTGTCTTAACAATGTCATCCTT-3’。

本发明还提供了用于快速鉴定唾液乳杆菌的试剂盒，包括上述的引物对。

优选地，还包括：PCR缓冲液、DNA模板、ddH2O、PCR MIX。