[发明专利]一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法及在CAR-T细胞植活上的应用

说明书

本发明公开了一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法及在CAR‑T细胞植活上的应用。利用25mg/(kg/d)环磷酰胺联合2.5mg/(kg/d)氟达拉滨对恒河猴进行预处理，建立与人类免疫抑制状况下的各项免疫指标变化趋势一致的疾病模型，血液学中的白细胞数(WBC)、淋巴细胞绝对数(LYM)下降幅度都超过50％；流式细胞检测结果CD3下降了40％以上，免疫抑制动物模型造模成功；利用该模型进行CAR‑T细胞的植入用于研究CAR‑T免疫疗法。本发明可以快速准确建立恒河猴免疫抑制动物模型，动物在CAR‑T细胞植入中能够保证足够的免疫抑制，使CAR‑T细胞在恒河猴体内植活，为CAR‑T免疫疗法临床前研究提供了更为理想、可靠的非人灵长类实验动物模型及完善的评价体系。

技术领域

本发明属于构建动物模型领域，具体的涉及一种恒河猴免疫抑制模型的构建方法及在CAR-T细胞植活上的应用。

背景技术

当今肿瘤治疗手段与日俱增，除常规手术、放疗和化疗之外，肿瘤免疫疗法作为癌症治疗的“第四支柱”引起广泛关注，它将过去重复的症状控制转为一次性的治疗甚至治愈，给生物医学带来新的希望。其中，嵌合体抗原受体工程T(CAR-T)细胞治疗是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗手段，即通过体外对T细胞修饰使其能靶向肿瘤抗原并产生相应免疫反应，在多项临床研究中取得了巨大的成功。嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)指将T淋巴细胞从病人体内分离出来，在体外培养、改造并扩增后，把体外改造、扩增的T淋巴细胞回输到病人体内以治疗肿瘤。这里的CAR指的就是嵌合抗原受体，由胞外抗原结合域scFV、跨膜结构域和胞内信号转导结构域组成。其通过基因编辑技术，将能识别肿瘤相关抗原的抗体融合表达于自体T细胞的表面，被修改的T细胞因此具有对肿瘤细胞的靶向杀伤力。目前全球已有CAR-T药物相继获得批准上市，极大地促进了CAR-T产品的研发和应用热潮。

从细胞移植研究的结果来看，免疫排斥依然是影响移植物存活的重要因素。CAR-T细胞给予免疫功能正常的动物时会发生免疫应答，导致细胞被清除或者出现免疫排斥反应，从而无法获得对临床有充分预测意义的有效性和安全性信息。我们前期的实验证实，同种异体CAR-T细胞在没有进行免疫抑制剂处理的恒河猴体内难以成功植活。

在已有的模式动物中，非人灵长类与人类的亲缘性最高，而且其免疫系统与人的最为相似。因此，临床前研究用非人灵长类所得出的实验结果具有较高的可靠性。对于天然免疫系统，非人灵长类与人十分相似，而与啮齿类有很大不同。Ketloy等发现猕猴的血液树突状细胞(Dendritic cell，DC)以及单核细胞来源的DC(monocyte-derived dendriticcell，MDDC)表达与人类相同的TLR(参与非特异性免疫)，但与小鼠DC亚群基本不同，并且通过上调CD40和CD86的表面表达来响应4种TLR对应的激动剂。非人灵长类动物的免疫系统，理论上可交叉识别人和猴特异性抗原的CAR-T细胞，可以模拟CRS和神经毒性等临床上发现的毒性反应。同种异体CAR-T细胞体内存活周期较短，经过长期研究已经确定淋巴消耗性化疗是有效的T细胞体内扩增所必需的。T细胞在转移到淋巴细胞减少的宿主后，会经历一个称为稳态膨胀的过程。

从临床试验反馈得到的诸如疗效、安全性的问题，需要通过临床前的基础研究以及动物试验等进行改进和优化，再反馈回临床以制定优化的治疗方案。而在CAR-T产品的临床前研究中，免疫抑制动物模型是不可或缺的关键性工具。如何成功构建契合各种研究需求的免疫抑制动物模型已经成为亟待解决的课题。去除胸腺、辐射损伤、基因敲除和免疫抑制剂应用等各种实验动物免疫抑制模型构建方式中，免疫抑制剂模型因其成本较低、操作简单而在目前的免疫学研究中应用广泛。