[发明专利]一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺

说明书

本发明涉及人免疫球蛋白灭活技术领域，具体涉及一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺，以血浆为原料制备富集有免疫球蛋白的蛋白溶液，对所述蛋白溶液进行巴氏灭活，所述蛋白溶液中含有300～400g/l的山梨醇和终浓度为80～120g/l的甘氨酸，所述蛋白溶液的pH值为6.0～7.5，蛋白浓度为10～30g/L。本方案可以解决现有的巴氏灭活人免疫球蛋白工艺难以同时保证蛋白收率和质量的技术问题。本方案可以应用于人免疫球蛋白的生产和制备的实践操作中，简单易行，成本低廉，蛋白收率可达95％以上，具有极大的推广应用价值。

技术领域

本发明涉及人免疫球蛋白灭活技术领域，具体涉及一种使用组合保护剂的球蛋白巴氏灭活工艺。

背景技术

巴氏灭活是一种在国际上被认可的、安全性高的对病毒和其他生物体的灭活有效的方法，巴氏灭活通常是在高温条件下对蛋白质溶液进行连续加热10小时以上，灭活病毒。巴氏灭活方法只需控制温度和时间两个参数，操作容易、设备简单、利于放大和节约成本等优势。在病毒灭活的过程中温度很容易被监测，巴氏灭活对脂包膜病毒和非包膜病毒均有灭活作用，灭毒范围广，且易于实现。作为一种传统成熟的病毒灭活方法，巴氏消毒法可以用于白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制剂等血液制品的脂包膜和非包膜病毒的灭活。除了杀菌和灭活病毒外，巴氏灭活方法还能使制品中杂蛋白聚集沉淀，降低凝血激活物如活性的凝血因子Ⅺa、PKA水平，提高产品安全性。

在行业法规方面，国家一直强调生物制品/制剂的安全性，要求在整个生产过程至少包含两步及以上的病毒灭活/去除步骤。生物制品/制剂在制备过程中由于巴氏灭活稳定性差的问题，多采用S/D灭活、巴氏灭活、低pH孵放和纳米膜过滤等技术灭活/去除病毒。而S/D灭活法会残留S/D剂、低pH孵放法会造成球蛋白分子裂解、纳米膜过滤成本高昂，目前巴氏灭活已成为国际上通用的灭活病毒的方法，其安全性和有效性已经过多种产品的临床验证，也已经被国际上各类权威机构共同的认可。2010年，血液制品厂家OctapharmaPharmaceutika(奥地利维也纳)改变了静注人免疫球蛋白即5％的制造工艺，改变后的生产工艺中不包含巴氏灭活工艺步骤，在临床上造成严重的血栓栓塞事件，并在同期召回了所有该批次在售产品。Dr.Marta Jose等在“Pasteurization inactivatesclotting enzymes during Flebogamma and Flebogamma DIF production”中指出，在静注人免疫球蛋白(pH4)生产工艺中巴氏灭活是去除促凝污染蛋白的关键步骤，能降低凝血因子至检测限以下。

虽然巴氏消毒法目前已成为一种广泛的血液制品病毒灭活方法，但仍然存在着一些局限性，球蛋白分子在溶液中加热时会聚集，形成多聚体，降低产品纯度，提高后续工艺纯化难度。在加热条件过程中还会导致蛋白质结构变化的，使蛋白质的活性降低、构想改变，从而影响巴氏灭活后的蛋白的收率。现有的球蛋白巴氏灭活生产工艺中，由于保护剂及制品参数的差异，球蛋白纯度不同，蛋白收率也不一样，收率约为40～70％。张南等在专利CN 103550780B(一种巴氏灭活静注人免疫球蛋白的蛋白质保护剂及其灭活方法)中也对球蛋白巴氏灭活方法进行了优化，但只考察了多聚体含量，没有综合考虑蛋白收率问题，多聚体可以在后期制品精纯时去除，但蛋白收率只能在这一步提高。在血液制品方面，原料是多人份的健康人血浆，通过低温乙醇法、离子交换色谱法或其他已知的方法，提纯和分离球蛋白。其原料来源的稀缺性，决定了在每一步的生产过程中都需尽力回收球蛋白，减少球蛋白损失，提高产品的质量。而且其巴氏灭活保护剂种类采用了四种物料，物料种类多，在后期产品纯化时难度大，如终产品不采用这几种物料作为保护剂还要考察其残留问题，影响产品安全性。专利中采用巴氏灭活pH为4.7～5.3，接近低pH条件，低pH条件是造成免疫球蛋白降解的主要原因，免疫球蛋白在低pH条件下，Ig分子二硫键会断裂为Fab和Fc段失去活性，影响产品的有效性。为了克服现有技术中的缺陷，亟需研发出一种能够同时保证人免疫球蛋白的收率和质量以及产品安全性的灭活工艺，以满足实际应用的需求。

发明内容