[发明专利]一种高纯度熊去氧胆酸的制备方法

说明书

本发明提供了一种耐碱性7β‑羟基类固醇脱氢酶(7β‑HSDH)以及利用该耐碱性7β‑HSDH酶进行制备高纯度熊去氧胆酸的方法，属于生物技术领域。所述耐碱性7β‑HSDH酶的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示氨基酸序列相比，在SEQ ID No.1所述序列的第228位丝氨酸存在突变，所述第228位丝氨酸突变为苯丙氨酸或缬氨酸，所述方法包括利用该耐碱性7β‑HSDH酶制备熊去氧胆酸的步骤。本申请提供的耐碱性酶以及利用该耐碱性酶制备熊去氧胆酸的方法，能够显著提高从原料7K‑LCA转化为熊去氧胆酸的转化率，并且产品纯度高，符合药典的要求，即该方法能够低污染、可持续、易工业化的获得高质量的熊去氧胆酸。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种高纯度熊去氧胆酸的制备方法，还涉及制备高纯度熊去氧胆酸的耐碱性酶。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)的化学名称为：3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24酸，分子式为C₂₄H₄₀O₄，分子量392.58，白色结晶粉末，熔点200-203℃，无臭，易溶于乙醇、冰醋酸、氢氧化钠试液，在三氯甲烷中不溶。

UDCA是一种无毒性亲水胆汁酸，可以竞争性抑制毒性内源性胆汁酸在回肠中的吸收。通过激活Ca²⁺、蛋白激酶C组成的信号网络，来激活分裂活性蛋白激酶，从而增强胆汁澉积肝细胞的分泌能力，使血液及肝细胞中的内源性疏水胆汁酸浓度下降，可用治疗胆汁淤积行疾病。在临床上，熊去氧胆酸主要用于溶解胆固醇型胆结石，原发性胆汁肝硬化PBC，慢性丙型肝炎，同时还用于酒精性肝病，非酒精性脂肪肝、良性复发性肝内胆汁淤积症、先天性内胆管囊性扩张症，是治疗肝硬化的一线药物，临床上疗效好，副作用小，应用广泛，市场缺口大。

目前，国内外主要使用化学法以鹅去氧胆酸为原料经过氧化、还原两步化学反应制备熊去氧胆酸，反应过程中使用氧化、还原剂和大量的溶剂，且鹅去氧胆酸转化率较低，只有80％左右的鹅去氧胆酸转化为熊去氧胆酸，后处理需要进行拆分，精制等过程，且产物中含有鹅去氧胆酸及其他双氧化物杂质很难除掉，对产品质量影响很大，目前市售的熊去氧胆酸纯度不高。

绿色酶催化工艺这几年蓬勃发展，但是受制于原料7K-LCA在弱碱性水溶液中的溶解度有限，生物酶对有机溶剂的耐受度差，稳定性差及工作pH与反应体系不相容等共同缺陷，使生物法合成UDCA转化效率低，产品杂质多无法满足药典要求，难以实现产业化生产。

并且，原料3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸即7K-LCA，在中性溶剂中的溶解度低，较低的溶解度直接导致反应效率难以提升。而7K-LCA在偏碱性溶液中的溶解度高，但是在利用酶转化方法制备时，碱性越强，酶的活力越差，反应效率仍难以提升。

现有技术中提供了一些利用酶转化7k-LCA制备熊去氧胆酸的方法，例如CN107980064A、CN105861613A、CN106520888A和CN108251491A等。然而，包括上述专利的现有技术均未能关注熊去氧胆酸相关酶的耐碱性，因此熊去氧胆酸的提取效率和纯度均难以进一步提高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明旨在提供一种用于制备高纯度熊去氧胆酸的耐碱性酶，以及利用耐碱性酶高效转化7K-LCA制备熊去氧胆酸的方法，使得制备出的熊去氧胆酸产品纯度达到99.5％以上，ee值95％，单杂含量小于0.5％，符合药典的要求。

一方面，本申请提供了一种耐碱性7β-HSDH酶，所述耐碱性7β-HSDH酶的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示氨基酸序列相比，在SEQ ID No.1所述序列的第228位丝氨酸存在突变，所述第228位丝氨酸突变为苯丙氨酸或缬氨酸。

另一方面，本申请还提供了编码上述耐碱性7β-HSDH酶的核酸。