[发明专利]一种生产复苏促进因子RpfB的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种生产复苏促进因子RpfB的基因工程菌株及其应用。本发明通过宿主细胞中引入外源的复苏促进因子RpfB基因并表达复苏促进因子，从而实现了应用工程菌制备复苏促进因子RpfB，所表达的复苏促进因子RpfB‑OX12401应用于吡啶红球菌GX12401 VBNC状态和环境中革兰氏阳性菌的复苏与生长。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种生产复苏促进因子(ResuscitationPromoting Factor B，RpfB)的基因工程菌和利用该基因工程菌快速制备RpfB重组蛋白的方法，具体涉及重组蛋白的应用。

背景技术

(Resuscitation Promoting Factors)Rpfs是由细菌自分泌或旁分泌的一类可以在pmol级别下促进活的不可培养(viable but non-culturable，VBNC)菌体复苏和生长的蛋白质。Rpfs作为拥有内切作用的肽聚糖水解酶，分泌的天然蛋白和重组蛋白都能裂解细胞壁的合成底物4- 甲基伞形酮基β-D-N，N`，N``-三乙酰基壳三糖苷(4-Methylumbelliferyl N，N′，N″-triacetyl-β -D-chitotrioside，4-MUF-3-NAG)。VBNC状态的细菌会形成不同于活跃状态的厚细胞壁，虽然厚壁构成了一种有效的保护屏障，但它也可能对细胞的正常生长造成阻碍，因此细胞壁重塑是将休眠细胞恢复到活跃的生长状态所必需的。Rpfs作为肽聚糖水解酶是在肽聚糖骨架内部裂解，从而促使细胞壁恢复到活跃的状态。Rpf基因在放线菌不同属的拷贝数从1个到5个不等，但所有Rpf蛋白都有一个氨基酸序列相似的保守域(大约70个氨基酸残基)。

本研究以红树林沉积物为样品，获得一株产RpfB的吡啶红球菌2401(Rhodococcussp.)。通过对该菌株发酵分离上清液和促生优化，并初步分析粗酶液酶学性质。根据NCBI该菌全基因组序列设计引物调取RpfB基因，构建工程菌株进行RpfB基因片段全长克隆与表达。将该基因与其他RpfB基因进行序列比对，了解进化关系，并对RpfB序列进行生信分析，初步了解蛋白质的性质。采用镍柱对异源表达的RpfB进行纯化，对酶学性质进行研究，为RpfB在筛选新的功能菌株、生物修复、环境污染处理和农业生产中应用提供了基础。

目前，随着分子生物学技术的不断进步，利用基因工程的手段获得工程菌与野生菌株相比往往具有表达水平高、产物专一性强、生产的效率高、繁殖周期短、易分离等特点，因此在微生物体内异源表达Rpfs蛋白的基因逐渐引起诸多学者的兴趣。Rpfs复苏VBNC状态的菌株能力强，使用范围广，可操作性强，在医学、营养学、生物技术、农业等领域都具有广阔的市场开发前景。

本发明解决的问题在于提供一种生产重组复苏促进因子RpfB的基因工程菌，应用于促进吡啶红球菌自生以及环境中革兰氏阳性菌的VBNC状态复苏与生长。

发明内容

本发明具体采用的技术方案如下：

一种生产复苏促进因子RpfB的基因工程菌，该基因工程菌是原核细胞，其具有包含复苏促进因子RpfB基因片段的外源性表达载体；所述的复苏促进因子RpfB基因片段的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.1所示。

进一步的，所述的包含细菌复苏促进因子基因片段的表达载体是pET30a(+) -rpfB-GX12401。

本发明的另一目的在于提供一种由上述基因工程菌生产的RpfB重组蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种上述RpfB重组蛋白在促进VBNC状态吡啶红球菌和环境中革兰氏阳性菌的复苏与生长。

进一步的，所述微生物为吡啶红球菌GX12401。

本发明中，通过基因工程菌生产RpfB-GX12401重组蛋白并促进VBNC状态吡啶红球菌以及环境中革兰氏阳性菌的复苏和生长，是通过以下技术方案来实现：