[发明专利]一种检测EGFR基因外显子19突变的引物组及其应用、包含该引物组的试剂盒以及方法

说明书

本申请涉及生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测EGFR基因外显子19突变的引物组及其应用、包含该引物组的试剂盒以及方法，该引物组包括正向引物SEQ ID No:1、反向引物SEQ ID No:2、探针SEQ ID No:3和PNA SEQ ID No:4，本申请的引物组用于检测EGFR基因外显子19突变。

技术领域

本申请涉及生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测EGFR基因外显子19突变的引物组及其应用、包含该引物组的试剂盒以及方法。

背景技术

EGFR(表皮生长因子受体)是一种由EGF家族细胞外配体激活的跨膜受体。EGFR可与其他ErbB家族成员同二聚或异二聚以启动信号传导，激活下游信号通路，包括典型MAPK和PI3K/AKT/mTOR信号级联，最终导致细胞增殖、迁移和分化。在肺癌中，EGFR的激活突变导致对EGFR酪氨酸激酶抑制敏感的受体的组成性激活形式。靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂，包括阿法替尼、厄洛替尼和吉非替尼被称作第一/二代抑制剂，已被批准用于非小细胞肺癌患者的一线治疗。EGFR酪氨酸激酶激活突变包括EGFR L858R、19外显子插入/缺失、T790M、G719X、20号外显子插入等，其中EGFR 19外显子插入/缺失突变为常见突变，与L858R一起占所有突变类型超过90％。EGFR19外显子插入/缺失涉及到插入和缺失突变两种，且均有多种突变类型，EGFR19外显子缺失突变已报道有超过20种，插入突变接近10种，这也给临床检测工作带来了巨大挑战。

目前，检测EGFR 19外显子插入或缺失突变的最常用方法是TaqMan-qPCR法和NGS测序法，其中NGS测序法操作繁琐，检测周期久，价格昂贵。TaqMan-qPCR法检测EGFR 19外显子插入或缺失突变依赖于能够识别突变位点的特异性引物或TaqMan探针，但是，该方法需要设置多重引物或多重荧光探针，因此设计较为复杂，且只能检测已知的突变位点。

发明内容

本申请的实施例提供一种检测EGFR基因外显子19突变的引物组及其应用、包含该引物组的试剂盒以及方法。该方法利用试剂盒对EGFR基因外显子19突变进行检测。其特异性高，灵敏度高，检测周期短。

为达到上述目的，本申请的实施例采用如下技术方案：

第一方面，本申请实施例提供了一种检测EGFR基因外显子19突变的引物组，引物组包括扩增引物对、探针与PNA。

扩增引物对的序列如下：

正向引物：5’-TGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3’SEQ ID No:1。

反向引物：5’-GGTTGTCCACGCTGGCCATCA-3’SEQ ID No:2。

探针的序列为：5’-CCAACAAGGAAATCCTCGATG-3’SEQ ID No:3。

PNA的序列为：5’-GGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’SEQ ID No:4。

本申请实施例提供的引物组，利用该引物组检测EGFR 19外显子插入/缺失突变。该检测方法利用扩增引物对，靶向19外显子突变位点对应的野生型序列的特异性肽核酸作为Blocker，以及位于Blocker后的特异性FAM探针。利用Blocker与DNA结合稳定以及不被Taq酶降解的特性封闭EGFR 19Del对应的野生型位点，因此无法被有效扩增从而抑制扩增；当存在EGFR 19外显子插入或缺失突变时，Blocker无法特异性结合，解除对PCR扩增的抑制作用，通过降解FAM荧光探针从而被有效检测。该方法可以覆盖所有EGFR 19外显子插入或缺失突变，解决了以往方法依赖于已知突变位点的弊端，且灵敏度高(0.1％)，特异性高，检测快速。

可选地，探针SEQ ID No:3的5’端连接有荧光基团，探针SEQ ID No:3的3’端连接有淬灭基团。