[发明专利]一种用于检测脊髓肌萎缩症相关基因的引物探针组合物及试剂盒

说明书

本发明提供了一种检测SMN1和SMN2基因拷贝数的引物探针组合物以及相关试剂盒，所述引物探针组合物包含SEQ ID NO:1～2所示的探针和SEQ ID NO:4～7所示的引物。本发明的引物探针组合物是针对中国人特有序列设计，具有更高的特异性，结果准确，操作简便。

技术领域

本发明属于生物技术及临床分子诊断领域，具体涉及脊髓性肌萎缩症的检测。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是儿童最常见的神经肌肉病，以脊髓前角α运动神经元退化变性导致的肌无力和肌萎缩为主要临床特征，主要表现为进行性、对称性四肢和躯干的肌无力，近端重于远端，下肢重于上肢，有时可见舌肌纤颤、手震颤；临床检测包括血肌酶谱、肌酸激酶(CK)值正常或轻度升高，绝大多数患者不超过正常值的10倍，肌电图提示神经源性损害。SMA发病率约为1/10000，人群携带率为1/50。

SMA为常染色体隐性遗传病，致病基因为SMN1，修饰基因为SMN2，SMN1决定疾病的发生，SMN2影响疾病的严重程度和进展。SMA突变基因型95％由SMN1双等位基因纯合缺失所致，由于SMN1基因外显子8位于非编码区，SMN1缺失通常指外显子7缺失。SMN2拷贝数是目前公认的SMA修饰因子，患者携带SMN2拷贝数越多表型越轻；尽管其与表型的相关性不完全一致，在国内外管理共识中仍将SMN2拷贝数作为SMA诊断的标准步骤之一。SMA基因诊断的主要目标基因为SMN1和SMN2，其中SMN1拷贝数和致病性变异的检测结果用于疾病诊断或排除诊断，SMN2拷贝数的检测结果作为患者诊断后的治疗、临床管理和预后评估的参考指标。

目前SMA相关基因SMN1和SMN2拷贝数变异检测主要通过多重连接探针扩增法(MLPA)和荧光定量PCR法进行检测。

MLPA方法针对SMN1与SMN2基因第7和第8外显子碱基差异位点(c.840位点C/T和c.*239位点G/A)设计杂交位点(c.840位点C/T和c.*239位点G/A)设计杂交探针，采用其他染色体位点的多个管家基因作为内参基因，以SMN1∶SMN2不同拷贝数的样本作为平行对照，在完成杂交连接等系列反应后，根据荧光峰面积的比值比来判断目标基因序列的拷贝数。MLPA技术通过直接检测SMN1拷贝数，明确区分患者、携带者及正常人；还可同时检测患者的SMN2拷贝数，是目前国内外SMA管理共识推荐使用诊患者、携带者及正常拷贝数，是目前国内诊断SMA的金标准。虽然MLPA技术特异性好，临床应用较为成熟，但其对设备要求高(需要高成本的基因分析仪)、成本高(仅MLPA试剂盒中的试剂每孔的成本高于100元)、操作步骤多(一般需要四步操作，变性-杂交-连接-扩增)、检测周期长(48小时以上)，限制了该技术的进一步推广应用。

荧光定量PCR：主要原理是通过多重实时荧光定量PCR反应，以管家基因序列为内参，采用Taqman探针法分别对SMN1基因进行拷贝数相对定量，来判断是否发生缺失变异。该方法优势是操作简便(仅需要一步扩增)、成本低廉(每个标本的成本低于40元)检测周期短(4小时之内出结果)，适用于人群筛查。目前在国内仅有一家相关基因的检测，但是仅有SMN1基因拷贝数的检测，尚无SMN2基因拷贝数检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种针对SMN1基因(NCBI Gene ID:6606)7号外显子和SMN2基因(NCBI Gene ID:6607)7号外显子缺失(拷贝数变化)检测的特异性引物和探针，采用该核酸组合与相应的Taqman探针混合进行多重荧光PCR检测的方法；通过检测荧光信号的有无或强弱，通过相对定量的计算方法判断相应的基因拷贝数是否存在缺失(拷贝数变化)，具有较高的灵敏度和较强的特异性。

为实现本发明的目标，在第一个方面，本发明提供一种检测SMN1和SMN2基因拷贝数的引物探针组合物，其包含SEQ ID NO:1～2所示的探针和SEQ ID NO:4～7所示的引物。

注：RPP30,Gene ID:10556。