[发明专利]检测VHL基因c.-195GA位点突变的方法、引物和试剂盒

说明书

本发明公开了检测VHL基因c.‑195GA位点碱基突变的方法、引物和试剂盒，采用Touch‑down PCR扩增技术和Sanger测序技术，可用于快速检测患者体内VHL基因c.‑195GA位点突变情况。利用本发明的试剂盒进行检测的结果准确，对希佩尔‑林道(von Hippel‑Lindau，VHL)综合征有辅助诊断价值。

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测VHL基因c.-195G＞A位点突变的试剂盒，采用Touch-down PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测患者体内VHL基因c.-195G＞A位点的突变情况。

背景技术

希佩尔-林道(von Hippel-Lindau，VHL)综合征是一种常染色体显性遗传的家族性肿瘤综合征，发生率约为1/36000，以视网膜、神经系统血管母细胞瘤，肾细胞癌，肾上腺嗜铬细胞瘤等为特征，中枢神经系统血管母细胞瘤和肾细胞癌是最常见的死亡原因。根据VHL综合征患嗜铬细胞瘤的风险，临床上可分为两大类型：I型(不患嗜铬细胞瘤)和Ⅱ型(患嗜铬细胞瘤)。Ⅱ型根据患者患肾透明细胞癌的危险性高低分为三类亚型：ⅡA(低危)、ⅡB(高危)以及ⅡC型(仅表现为嗜铬细胞瘤)。临床上VHL综合征以I型最为多见，其次为ⅡA型。

VHL综合征发病机制至今还不是完全清楚，其中研究比较多的是低氧诱导因子-1(HIF-1)通路。VHL基因是一种抑癌基因，位于常染色体3p25-26区域，正常情况下，VHL蛋白可参与血管形成、细胞周期的调控并参与细胞外纤维连接素基质的形成或装配等，而VHL基因发生突变后导致其蛋白质结构发生改变，不能识别HIF-α，造成HIF-α无法降解，HIF-1转录激活靶基因大量表达，如TGFα、VEGF、PDGFβ、NF-κB等，从而引起细胞生长和微血管形成，加速血管母细胞瘤、肾细胞癌及与VHL病有关的其他肿瘤的生长。

VHL综合征的特征基因为VHL，研究显示所有VHL综合征患者都存在胚系VHL等位基因的异常，因此确诊VHL综合征需检测到VHL基因的异常。VHL基因中常发生种系突变的3个区域分别是：75-82号密码子、157-189号密码子、外显子2与3之间的剪切位点。其中基因突变多发生在密码子65、76、78和98，剪切突变则多发生在密码子155、158、161、162和167。临床两大类型间的VHL综合征，其VHL基因突变存在有明显的不同，I型主要表现为VHL基因的缺失、无义突变及移码突变，而Ⅱ型主要表现为VHL基因的错义突变。

由于VLH综合征受累器官多样性，且可同时或先后发病，间隔时间可长达10年以上，因此临床医生对诊断该疾病存在较大困难。而VHL基因检测是准确有效的诊断方法，特别对无症状的VHL病患者可以早期发现、早期治疗，减缓疾病进程，提高治疗效率。

发明内容

本发明的目的是提供一个检测VHL基因c.-195G＞A位点突变的试剂盒，采用Touch-down PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测患者体内VHL基因c.-195G＞A位点的突变情况。所述检测VHL基因c.-195G＞A位点突变的试剂盒，包括：扩增VHL基因c.-195G＞A位点的引物，其碱基序列为：

VHL-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTATAGTGGAAATACAGTAACGAGT

VHL-R:AACAGCTATGACCATGCGTGCTATCGTCCCTGCT。

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG。

本发明还提供了检测VHL基因c.-195G＞A位点突变情况的方法，包括以下步骤：

(1)抽提外周血中的基因组DNA；

(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；