[发明专利]一种生产N-乙酰葡萄糖胺基因工程菌的构建及应用

说明书

本发明公开了一种生产N‑乙酰葡萄糖胺基因工程菌的构建方法及应用，该工程菌是通过将编码氨基葡萄糖合成酶、氨基葡萄糖乙酰转移酶和磷酸甘油酸脱氢酶基因导入大肠杆菌表达，并敲除大肠杆菌中N‑乙酰葡萄糖胺分解利用代谢途径酶的基因构建而成的重组大肠杆菌；构建的工程菌株利用葡萄糖为底物进行发酵培养合成N‑乙酰葡萄糖胺。本发明的工程菌合成N‑乙酰葡萄糖胺发酵水平高，同时副产物累积较少，具有工业化生产潜力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种将基因工程改造运用于大肠杆菌构建基因工程菌生产N-乙酰葡萄糖胺。

背景技术

N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc，CAS 134451-94-8)是葡萄糖的衍生物，具有还原性，广泛存在于各种生物体内。包括细菌、酵母、丝状真菌、植物以及动物，其中在海洋生物类动物的外骨骼中含量最高。医药方面，N-乙酰葡萄糖胺可以作为抗消炎药物，用于治疗风湿性关节炎症，其还可以提高内质网蛋白内稳态，延长细胞寿命。食品方面，N-乙酰葡萄糖胺作为膳食补充剂，具有保护软骨组织及骨关节炎的作用。此外，还可以应用于化妆品和饲料添加剂中，用途十分广泛。

N-乙酰葡萄糖胺传统的生产方法主要有甲壳素水解法及酶转化法，其中最主要的生产方法为甲壳素水解法，但该方法存在许多问题。水解法的原料为虾壳或蟹壳等，这些原料可能存在过敏原，容易引发海鲜过敏人群发生过敏反应；其次，随着市场对N-乙酰葡萄糖胺的需求量日益增长，甲壳素作为一种有限资源，可能会出现供不应求的现象；而且，在水解过程中，需要使用大量的酸和碱，会造成严重的环境污染。而使用酶解法，也存在原料有限、甲壳素酶造价昂贵、转化时间长、效率低等问题，不适合工业化生产。

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)是一种革兰氏阴性、兼性厌氧细菌，由于其具有生长周期短、易于培养、代谢可塑性强、具有丰富的生物化学和生理学背景等特点，成为代谢工程和合成生物学的最佳宿主之一，也是工业中最重要的生物体之一。因此，国内外开展了利用大肠杆菌发酵生产N-乙酰葡萄糖胺的工作，利用代谢工程构建一系列代谢工程菌，通过优化发酵参数，获得生产N-乙酰葡萄糖胺的生产工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产N-乙酰葡萄糖胺基因工程菌的构建方法，以及其在生产N-乙酰葡萄糖胺中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种新型的发酵稳定、周期长、产物转化率高的生产N-乙酰葡萄糖胺的基因工程菌构建方法及应用。该基因工程菌首先通过RED同源重组技术敲除N-乙酰葡萄糖胺分解代谢利用途径，随后将表达氨基葡萄糖合成酶、氨基葡萄糖乙酰转移酶和磷酸甘油酸脱氢酶基因借助外源表达载体导入大肠杆菌表达。

根据本发明的优选实施例，所述大肠杆菌原始菌株购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

所述氨基葡萄糖合成酶基因来源于大肠杆菌W3110，经全基因合成。

所述氨基葡萄糖乙酰转移酶基因来源于酵母菌S288C经全基因合成。

所述氨基葡萄糖合成酶、氨基葡萄糖乙酰转移酶基因导入大肠杆菌表达，是将这两个基因克隆到表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆菌中表达。

上述高产N-乙酰葡萄糖胺基因工程菌的构建方法，具体步骤包括：敲除大肠杆菌中的manXYZ、nagBACDE基因簇，将glmS、GNA1基因分别克隆到表达载体上，转入敲除了manXYZ、nagBACDE基因簇的大肠杆菌中，获得高产N-乙酰葡萄糖胺基因工程菌。其中，该构建方法，更加具体的步骤包括：

(1)敲除大肠杆菌manXYZ、nagBACDE基因簇，获得基因簇manXYZ、nagBACDE失活的菌株；

(2)全基因合成编码氨基葡萄糖合成酶的glmS基因(SEQ ID NO.18)，以及编码氨基葡萄糖乙酰转移酶的GNA1基因(SEQ ID NO.17)，并克隆至表达载体；