[发明专利]一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法

权利要求书

1.一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法，包括海水取样(一)、原生动物种群分离(二)、细菌清除率对比(三)、生物安全性分析(四)、生物鉴定(五)、清除机制分析(六)、弧菌预防应用(七)。

2.根据权利要求1所述的一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法，其特征在于：所述海水取样(一)采集厦门南美白对虾养殖海水水样，用采样瓶轻微搅动，使水体变浑浊，底部的沉积物泛起，后拿广口瓶直接采水；同时掺入部分表层沉积物样品，盖上瓶盖，瓶盖未拧紧以保证瓶内有充足氧气，同时取500mL原位水一起带回实验室供后期培养使用。

3.根据权利要求1所述的一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法，其特征在于：所述原生动物种群分离(二)中，在取样的海水样品拿回实验室后，马上打开瓶盖透气，并轻微晃动后适量倒入培养皿中，培养皿中加入2-3粒米粒，25℃培养3-4天在显微镜下进行镜检，取不同形态的个体分别接入六孔板中，每个孔中加入原位海水和1粒米粒进行扩大培养，共获得7种原生动物的单一种群，分别命名为PW01～PW07。

4.根据权利要求1所述的一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法，其特征在于：所述细菌清除率对比(三)中，将大肠杆菌Escherichia coli DH5α,创伤弧菌Vibrio vulnificus GDMCC 1.733，哈维氏弧菌V.harveyi GDMCC 1.781，铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa CMCC 10104单菌落分别接种至80mL的LB培养基，25℃下以120rpm转速培养48小时。3000rpm/min离心，无菌海水洗涤5次，然后用无菌海水重悬，浓度调整为1×10⁷CFU/mL。

5.根据权利要求4所述的一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法，其特征在于：所述原生动物单一种群样品分别离心(1500rpm，15min)，无菌海水将沉淀虫体洗涤三次后，无菌海水重悬至浓度约100cells/mL，静置禁食24h后，取100只原生动物至100mL浓度为1×10⁷CFU/mL的不同细菌中，以未添加原生动物的细菌设为对照组，每组实验设置3个重复，25℃静置培养一周后，通过酶标仪测定OD₆₀₀，将原生动物添加入菌液时间点的OD设置为100％，共培养7天后OD₆₀₀变化百分率如图3所示，结果可见，与未添加原生动物的对照组相比，5种原生动物包括PW02、PW04、PW05、PW06和PW07均对4株受试细菌均有显著清除效果。

6.根据权利要求1所述的一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法，其特征在于：所述生物安全性分析(四)中，毒性试验生物采用卤虫，卤虫是一种鳃足纲的小型甲壳动物，在肠道形成后的幼体对毒性敏感，被广泛应用于毒性试验生物，为此用卤虫对原生动物的毒性进行分析，取卤虫卵2g放入1L大烧杯中，加入600mL海水，适量通气使其孵化，将具有明显细菌清除效果的原生动物培养液稀释5个不同浓度，每个浓度设3个平行，培养液注入6孔培养板中，每孔放入个体大小均匀的四日龄卤虫10只，在温度25℃下培养24小时，显微镜观察，用解剖针触动卤虫5秒内卤虫触角不动为死亡标准，测定不同浓度下卤虫的死亡率，计算卤虫死亡率达到50％时不同原生动物的半致死浓度LC₅₀，结果如图4所示，可见原生动物PW06半致死浓度最高，说明其对卤虫的毒性最低。