[发明专利]快速检测GI群诺如病毒的ERA方法、组合物和试剂盒

说明书

本发明涉及GI群诺如病毒的酶促重组等温扩增技术（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA）基础型和荧光型两种快速检测方法。本发明还涉及用于所述方法的寡核苷酸引物和探针组合物。本发明还涉及包含所述组合物的ERA检测试剂盒。使用本发明的组合物进行基础型或荧光型ERA检测，能够通过简单、快速、特异且灵敏地检测食品和粪便等样本中的GI群诺如病毒成分。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于GI群诺如病毒的基础型和荧光型ERA快速检测技术，用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，以及包含所述组合物的试剂盒。

背景技术

诺如病毒，又称诺瓦克病毒（Norwalk Viruses, NOV），是人类杯状病毒科（HumanCalicivirus, HuCV）中诺如病毒（Norovirus, NOV）属的一种无包膜单股正链的 RNA 病毒。NOV多以食物和水为载体，可以造成多种哺乳性动物以呕吐、腹泻为主的病毒性肠胃炎，是目前常见的食源性病毒之一。由 NOV 引发的感染性腹泻在世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要为成人和学龄儿童，其中每年10月至次年3月是高发期。美国每年在所有的非细菌性腹泻爆发中，60%-90%是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒感染发病率约15%左右。

诺如病毒基因组全长7.65 kb，主要有三个开放读码框（Open Reading Frame,ORF），即ORF1、ORF2、ORF3，分别编码与病毒复制相关的非结构蛋白、VP1结构蛋白和VP2结构蛋白。根据完整的VP1基因氨基酸多样性和ORF1上编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）区域的核苷酸多样性，可以将诺如病毒分为5个不同的基因群（GⅠ～GⅤ）。其中只有GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人。其中GI型基因群又包括9个基因亚型，分别命名为GⅠ.1-GⅠ.9，代表株为Norwalkvirus，包括Southampton virus.Desert shield virus等。我国目前最常见的诺如病毒感染主要为GⅠ群和GⅡ群，每年 NOV 的爆发都会对国家造成很大的医疗及经济负担，但是由于 NOV 的自身特性，无法在体外进行增值培养，导致目前为止没有特效的疫苗和药物，所以如何高效快速的检测 NOV成为了现代研究者迫切需要解决的问题。

生物体的遗传物质主要由核酸决定，随着分子生物学技术的快速发展，通过鉴别核酸来溯源生物成分的各种分子生物学技术具有特异性强，灵敏度高，不易受环境条件干扰，结果稳定等优点，在食源性致病微生物检测中的应用越来越广泛。并且对于形态结构非常简单的微生物的进化，则只有用分子生物学的方法才能得到可靠结果。然而目前广泛流行的PCR核酸扩增技术已经无法满足快速检测的需要，因为这些PCR技术通常检测时间在2h以上，并且需要配备专业的PCR核酸扩增仪，这些都限制了PCR核酸扩增技术的推广应用，因此，需要一种能够快速高效步骤简单的核酸检测方式，而酶促重组等温扩增技术（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA）符合这种要求。该技术原理是：在常温的环境下，重组酶与引物紧密结合，形成重组酶和引物的聚合体。当重组酶和引物聚合体在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构。然后，在DNA聚合酶的作用下，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA互补链，并完成扩增产物的指数级增长。因此在37～40℃的反应条件下即可对微量的DNA、RNA特异片段进行高效快速扩增，几分钟之内可以扩增数十亿倍。其低温适应性和灵敏度等方面取得了重大突破并达到国际先进水平。并且该技术是我国研发的具有全球自主知识产权等温核酸扩增技术，可以摆脱国外专利壁垒。该技术方便、准确、迅速，已成为近年来研究的热点。

发明内容