[发明专利]一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒及提取方法

权利要求书

1.一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒，该试剂盒中包括组织裂解液和细胞裂解液，其特征在于：

所述组织裂解液Buffer ATL组分为PMSF 0.1-1mol/L、Aprotinin 0.005-0.2umol/L、硫脲1-10 mol/L、DTT 0.1-1mol/L、NP-40 裂解液1%-5%、Triton X-100 0.5%-1.5%、pharmalyte 1%-5%、CHAPS 1%-10%、Tris 0.01-0.08mol/L、EDTA 0.1-1mol/L；

所述细胞裂解液Buffer AL组分为硫脲1-10 mol/L、脲1-10 mol/L、DTT 0.1-1mol/L、CHAPS 1%-10%、Tris 0.01-0.08mol/L；

所述试剂盒中还包括洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和Buffer AE；

洗涤液I的组分为1-10 mmol/L Tris-HCl、0.1-1mol/L NaCl、10-50％C₂H₅OH、0.5-2mol/L CH₅N₃∙HCl ，pH为6-7 ；

洗涤液II的组分为0.5-2.5 nmol/L NaAC、70-85% C₂H₅OH，pH为6-7；

Buffer AE为 9.5-10.5 mmol/L Tris-HCl、0.8-1.2mmol/L EDTA。

2.根据权利要求1所述的一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒提取宏基因组的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1去除石蜡：向装有组织切片的EP管中加入二甲苯，振荡混匀，室温离心16000 g，弃上清；加入无水乙醇，室温离心16000 g，弃上清；重复上述步骤1次后，打开EP管盖，37 ℃孵育，直至残余乙醇全部挥发；

S2样本组织破碎：在已脱蜡的组织块切片管内加入组织裂解液 Buffer ATL，转移到研磨管内进行研磨；研磨后管中液体转移到的离心管中；所述研磨管内有3颗3 mm氧化锆珠和5颗1 mm 氧化锆珠，研磨仪机器设置频率为50 Hz，研磨时间40 -60s；

S3样本DNA提取：向离心管内加入提前预热的蛋白酶K，充分混匀，56 ℃水浴1-2h，每隔15 min颠倒混匀一次；90 ℃水浴1 -2h，短暂离心，迅速加入细胞裂解液 Buffer AL和无水乙醇，充分混匀，离心；所述蛋白酶K浓度为10-40 g/L；

S4样本DNA吸附：转移混合物于QIAamp层析柱中，盖上盖子，过柱离心；

S5样本DNA洗涤：打开QIAamp层析柱，加入洗涤液I，盖上盖子，离心洗涤；将QIAamp层析柱放入一个干净的收集管中，加入洗涤液II，盖上盖子，离心洗涤；将QIAamp层析柱取出放入另一个干净的收集管中，离心，生物安全柜中静置使膜完全干燥；洗涤液I的组分为1-10mmol/L Tris-HCl、0.1-1mol/L NaCl、10-50％C₂H₅OH、0.5-2 mol/L CH₅N₃∙HCl ，pH为6-7 ；洗涤液II的组分为0.5-2.5 nmol/L NaAC、70-85% C₂H₅OH，pH为6-7；

S6样本DNA洗脱：将QIAamp层析柱放入新的EP管中，打开柱子，加入Buffer AE，室温盖上盖子静置5-10 min，20 ℃ 16000 rpm离心1 min，洗脱DNA，于-20℃保存；Buffer AE为9.5-10.5 mmol/L Tris-HCl、0.8-1.2mmol/L EDTA。

3.根据权利要求2所述的一种提取石蜡组织切片的试剂盒提取基因的方法，其特征在于：步骤S3中90℃孵育前若有沉淀，进行10000 g，3 min进行离心，留上清90 ℃水浴1 h，丢弃沉淀。

4.根据权利要求1所述的一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒的应用，其特征在于：用于石蜡切片病原微生物宏基因组的提取。