[发明专利]一种工程化外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种工程化外泌体及其制备方法和应用。本发明的外泌体，由细胞THP‑1依次用(12‑)十四酸佛波酯(‑13‑)乙酸盐PMA、脂多糖LPS诱导，所得M1巨噬细胞用DSPE‑PEG₂₀₀₀‑Mal的RMPI 1640培养，取上清液离心、超滤浓缩、再纯化得纯化外泌体；再用外泌体负载治疗药物并用Angiopep‑2或/和CD133 aptamer修饰，得工程化外泌体。本发明所得的工程化外泌体能靶向输送小分子药物或核酸药物通过血脑屏障，显著抑制神经胶质瘤细胞和神经胶质瘤干细胞的生长，诱导神经胶质瘤和神经胶质瘤干细胞的细胞凋亡并延长荷瘤小鼠的生存期，并且没有明显的副作用。因此，该新型工程化外泌体可用于脑部肿瘤的有效治疗。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种新型工程化的外泌体的制备和神经胶质瘤治疗应用

背景技术

神经胶质瘤是处于中枢神经系统的一种最具威胁的肿瘤，目前对它的标准治疗方案是首先手术治疗，再结合放射性治疗和化学治疗，但标准治疗方案效果较差。患者的5年生存期在5％左右。

STAT3是信号传导和转录激活家族的一员，该蛋白质能够控制神经胶质瘤下游的基因的转录并促进神经胶质瘤的发展，越来越多的证据表明STAT3是一个抑制神经胶质瘤的有前景的靶点。小干扰RNA(siRNA)是一种人工合成的双链RNA，它毒性较低，且能专一性的沉默细胞内部特定蛋白质的mRNA，现在已经用于治疗许多难以治愈的肿瘤，包括神经胶质瘤。但是应用siRNA沉默STAT3蛋白质治疗神经胶质瘤最大的困难是缺乏合适的siRNA载体。病毒载体具有很好的siRNA递送能力，但是它的免疫原性和基因诱变毒性严重影响到了病毒载体的应用。非病毒载体，包括聚合物、无机纳米颗粒和脂质体，也能够递送siRNA，但是非病毒载体的一些问题，比如安全性和递送的效率，限制了它们的广泛应用。此外应用siRNA用于治疗神经胶质瘤还存在潜在的免疫原性、细胞摄取差、血液循环短、血浆稳定性差、无法透过血脑屏障等问题。

目前对神经胶质瘤的标准治疗方案是手术治疗，再用放射性治疗和化学物质治疗。替莫唑胺是用于神经胶质瘤标准化学治疗的一线抗癌药物。但是神经胶质瘤细胞内部的DNA修复蛋白O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)可以修复替莫唑胺在鸟嘌呤O⁶处引起的烷基化损伤，使肿瘤细胞对替莫唑胺产生耐药性。通过将烷基转移到AGT的Cys145，O⁶-苄基鸟嘌呤增强替莫唑胺的细胞毒性，因此联合使用替莫唑胺和O⁶-苄基鸟嘌呤是一种有前景的治疗策略。由于O⁶-苄基鸟嘌呤有大量的不良反应，包括肝毒性、骨髓抑制和肺纤维化且其不能穿透血脑屏障，O⁶-苄基鸟嘌呤没能在临床上大量用于神经胶质瘤的治疗。因此，迫切需要开发一种可行的策略将治疗性药物递送到肿瘤组织中。

神经胶质瘤干细胞是神经胶质瘤细胞的一种亚群，该亚群对放射性治疗和化学治疗具有强大的抵抗作用。CD133表面蛋白质是神经胶质瘤干细胞的表面标志物，因此我们可以利用CD133aptamer靶向神经胶质瘤干细胞。

为了解决上述问题，本发明构建了一个新型的药物载体；为了克服病毒和非病毒载体的药物输送缺点，本发明利用外泌体作为药物靶向输送载体。外泌体作为一种应用潜力巨大的天然载体具有很多优势，比如能够穿透血脑屏障、血浆稳定性好、血液循环时间长和免疫源性低。鉴于M1巨噬细胞对肿瘤细胞具有趋向性，本发明利用M1巨噬细胞来源的外泌体进行工程化改造，实现药物靶向输送。因为神经胶质瘤和血脑屏障内皮细胞表面过表达低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)，An2，作为LRP-1的一种配体，可以促进外泌体穿透血脑屏障和靶向神经胶质瘤。

发明内容

鉴于目前治疗神经胶质瘤药物递送中存在的一些问题，本发明的目的在于提供一种新型工程化外泌体及其制备方法和应用，具体为用于治疗神经胶质瘤。