[发明专利]一种腺病毒质粒载体及腺病毒的制备方法

权利要求书

1.一种腺病毒质粒载体，包含5型腺病毒骨架基因序列，两个反向末端重复序列，启动子序列，多聚A尾序列，其特征在于：所述腺病毒质粒载体的启动子序列和多聚A尾序列之间有如SEQ NO.1所示的位点序列1及如SEQ NO.2所示的位点序列2，位点序列1及位点序列2中由一个唯一的平末端限制性核酸内切酶识别位点序列连接。

2.如权利要求1所述的腺病毒质粒载体，其特征还在于：所述位点序列1及位点序列2之间由一个SwaI限制性内切酶识别序列连接，连接后的序列如SEQ No.3所示。

3.如权利要求1所述的腺病毒质粒载体，其特征还在于：包含绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列位于另一启动子序列下游，用于编码绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。

4.如权利要求1或2所述的腺病毒质粒载体，其特征还在于：所述位点序列1与位点序列2之间有细菌自杀基因序列。

5.如权利要求4所述的腺病毒质粒载体，其特征还在于：所述细菌自杀基因序列为SEQNO.4所示ccdB表达盒，表达盒两端有SwaI酶切位点，所述的腺病毒质粒载体序列为SEQNO.5。

6.如权利要求5所述的腺病毒质粒载体，其特征在于：所述腺病毒质粒载体包含绿色荧光蛋白开放阅读框序列，序列为SEQ NO.6。

7.如权利要求5所述的腺病毒质粒载体，其特征在于：所述腺病毒质粒载体包含红色荧光蛋白开放阅读框序列，序列为SEQ NO.7。

8.一种一步法构建腺病毒的方法，包含以下步骤：

步骤1：设计5’端包含SEQ NO.1的上游引物及5’端包含SEQ NO.2的下游引物，PCR扩增获得目的基因；

步骤2：用限制性内切酶酶切位点序列1及位点序列2之间的识别位点序列，获得线性化载体片段；

步骤2：纯化后的目的基因片段与线性化载体片段混合，通过Gibson DNA组装，获得带有目的基因的重组腺病毒质粒；

步骤3：将带有目的基因的重组腺病毒质粒经PacI酶切线性化，转染到HEK-293或293A或293T腺病毒包装细胞中，5-7天收集细胞，裂解细胞获得腺病毒初提液；

步骤3：腺病毒初提液感染HEK-293或293A或293T细胞，进一步扩增，获得高滴度病毒液。

9.一种腺病毒试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-3或5-7所述腺病毒质粒载体。