[发明专利]一种基于分子技术的白斑狗鱼性别鉴定方法

说明书

本发明公开了一种基于分子技术的白斑狗鱼性别鉴定方法，本发明要求保护一种白斑狗鱼遗传性别的特异分子标记，其在白斑狗鱼X染色体和Y染色体中存在差异，可将此差异用于鉴别白斑狗鱼的遗传性别。本发明克服现有技术的不足，提供一种基于性别连锁的特异分子标记，可以简单快速地实现遗传性别，大大节省人力物力。

技术领域

本发明涉及属于水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术领域，具体涉及一种基于分子技术的白斑狗鱼性别鉴定方法。

背景技术

在雌性生长速度显著快于雄性的鱼类养殖中，通过性别控制技术实现全雌化养殖是提高其养殖产量的关键技术之一，白斑狗鱼就是这样具有经济价值二态性的鱼类。所以，白斑狗鱼性别相关的基因研究与日俱增。国内外学者也对白斑狗鱼的性别控制开展了一系列的试验研究。Luczynski等人诱导白斑狗鱼进行雌核发育，获得了全雌白斑狗鱼的雌核发育鱼苗，并确定了白斑狗鱼的雄性配子异型(XY)的染色体性别决定类。Demska-Zakes等人对白斑狗鱼鱼苗喂食11β-羟雄烯二酮后发现可以将其全部转化为雄性或间性。近来研究鱼类性别的决定机理和基因的研究取得了显著成效，张俊杰等人也做了许多相关的研究。

开展白斑狗鱼的遗传性别鉴定技术研究既有重要的科学意义，又有广阔的应用前景。传统的鱼类性别控制育种需要通过测交，来判断亲本基因型是否为XX伪雄鱼，耗时耗力。而基于该性别鉴定技术，可以简单快速地实现性别鉴定，大大节省人力物力。因此，本领域技术人员提供了一种基于分子技术的白斑狗鱼性别鉴定方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于分子技术的白斑狗鱼性别鉴定方法，提取白斑狗鱼鳍条DNA，采用4#引物(reseqSNP381)，

将4#引物(reseqSNP381)合成和溶解，用PCR扩增反应进行鉴别，

4#引物的序列分别为：

GGACTTTTTCCTACATACCTCAC和TCAGCCACTATATCTATCTTACCG。

优选的：白斑狗鱼鳍条DNA提取步骤如下：

(a)30mg的经过无水乙醇保存的鳍条样品组织尽可能地剪碎，风干1h；

(b)加入600μL裂解液，10μL蛋白酶K(20mg/ml)，混匀56℃水浴，裂解细胞2h；

(c)8000rpm 5min离心，取上清液550μL；

(d)加入550μL酚-氯仿异戊醇手动轻轻混匀10min，13000rpm、4℃离心10min；

(e)小心吸取400μL上清液(不要吸到中间的蛋白质)于新的EP管；

(f)加入800μL经过-20℃预冷的无水乙醇，-20℃放置30min，4℃、13000rpm离心10min；

(g)弃上清液，DNA是在EP管壁和底部的白色沉淀。加入70％乙醇，轻轻吹打后13000rpm离心5min；

(h)重复操作步骤g；

(i)加入70μL ddH₂O溶解；

(j)1.5％琼脂糖凝胶电泳，检验DNA提取效果可用全波长酶标仪测定浓度和纯度，根据酶标仪测定的DNA浓度，将各个DNA样品的浓度稀释调整到50-100ng/μL。

优选的：所述PCR扩增反应：操作步骤如下：

(a1)PCR反应体系：采用PCR反应预混液(mix)，每个反应12.5μL；

(b1)PCR反应程序如下：