[发明专利]一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基及其使用方法

说明书

本发明涉及一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基及其使用方法，属于生物化工技术领域。本发明提供了一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基，包括曲拉通X‑114和琼脂；曲拉通X‑114在固体培养基中的浓度为0.2‑10g/L。本发明还提供了使用固体培养基促进丝状菌长成独立菌落的方法，包括如下步骤：将曲拉通X‑114与水混合后高温蒸汽灭菌，待冷却后与乙醇在无菌环境中混匀，得混合试剂；将含琼脂的初始培养基液加热灭菌后取出，在凝固前依次加入混合试剂、丝状微生物的菌丝体和/或孢子，待冷却凝固后保温培养。本发明涉及的固体培养基及其使用方法，有利于独立菌落的形成，便于菌落的筛选计数，试剂制备简单，实验稳定性高，保存时间久，并且使用方法简单。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基及其使用方法。

背景技术

丝状真菌具有分泌大量酶或次级代谢产物的特殊能力，广泛用于多种工业应用。这种丝状真菌的最大特点就是在固体培养基上可以生长出大量的丝状气生菌体，且生长迅速，甚至相互交织，从而在固体培养皿中甚至形成互相连接的几个或一个大菌落。这种丝状真菌的菌丝形态可以在液体深层发酵条件下人工调节。有论文报道称使用鼠李糖脂和Triton X-100将液体深层发酵通常丝状的里氏木霉RutC-30改性成菌丝团，以提高纤维素的产量。此外，有人通过RNAi介导的基因沉默破坏了里氏木霉中的Trcot1蛋白功能，从而该木霉导致马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)上产孢延迟，而该木霉的一个双重突变体突变体SUS2/Trcot1i的菌丝生长变慢且菌丝体变短变粗。另外，也有研究者公开了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法及获得的突变菌株，具体涉及非洲哈茨木霉的突变。其具体步骤包括：制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液；对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变；诱变菌株的筛选；优良突变株酶活稳定性的测定。还有一种表面活性剂应用在丝状真菌曲霉属或根霉属的液体发酵中。该方法主要步骤为：在丝状真菌液体深层培养过程中，向种子培养基中添加醇胺类物质，这些醇胺类物质包括乙醇胺，二乙醇胺和三乙醇胺中的任意一种或者多种，其添加量优选为醇胺类物质的体积占培养基体积的0.1-2.0％，然后按体积比10-20％转接入发酵培养基中进行发酵培养。

表面活性剂Triton X-114，中文名字曲拉通X-114，为一种具有亲水性聚氧乙烯头部区域的非离子洗涤剂。曲拉通X-114常用于水相蛋白和脂蛋白的分离，如膜蛋白的提取等。有报道称曲拉通X-114可用于在温度诱导的相分离中帮助溶解疏水性膜蛋白和膜相关蛋白。其步骤包括：由来自B.burgdorferi菌的OspA基因编码的OspA膜蛋白被重组表达后，裂解该重组细胞，加入洗涤剂Triton X-114并混匀，当加热所获得的裂解混合物适当高温时，洗涤剂相与其他相分离，然后再通过柱层析纯化含有该蛋白质的洗涤相。其次，TritonX-114还用于去除内毒素的研究。有报道称用大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b、重组人生长激素、重组葡激酶蛋白粗提液为原料，反复抽提相分离法，用于去除蛋白粗提液中95％的细菌内毒素,蛋白收率保持85％以上，蛋白性质不受影响。也有人公开了一种Triton X-114和尿囊素去除重组蛋白质溶液中内毒素的方法，包括以下步骤：将重组蛋白质溶液中加入1mL Triton X-114，充分混溶得到混合物A，混合物A冰浴后于37℃条件下水浴放置一段时间并搅拌，25℃条件下，将搅拌均匀的混合物A离心并移出上层水相；将用于去除内毒素的尿囊素直接加到上层水相中，得到混合物B，将混合物B在室温下震荡20min；25℃条件下，将震荡后的混合物B离心去除底层沉淀，保留上清溶液，上清液即为去除内毒素的VP2重组蛋白质溶液。再者，Triton X-114还被应用在细胞裂解液组分中。例如有人公开一种人外周血淋巴细胞微核的检测方法，所用的裂解液中的溶质由氯化钠、柠檬酸钠、Triton X-114、RNase酶和绿色荧光染料组成，用于裂解用红色荧光染料染色的人外周血淋巴细胞。