[发明专利]一种鉴别基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种鉴别基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的方法及其试剂盒，属于病毒分子检测领域。为克服临床上缺少对基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒鉴别的方法，本发明提供一种基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的鉴别方法以及引物和探针，所涉及引物和TaqMan探针是依据乙脑病毒的prM/M基因保守区和盖他病毒的E2基因保守区进行设计，其可以有效鉴别乙脑病毒和盖他病毒，具有较高特异性和灵敏度的优点，可以为乙脑病毒和盖他病毒基因型的快速检测、临床诊断以及流行病学调查提供更好的方法支持。

技术领域

本发明属于病毒分子检测领域，涉及一种鉴别基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的方法及其试剂盒。

背景技术

日本脑炎(Japanese Encephalitis,JE)又称流行性乙型脑炎，是由乙型脑炎病毒(Janpanese Encephalitis,JEV)引起的一种人兽共患的疾病。乙型脑炎是一种自然疫源性疾病，一年四季均可发生但主要出现在夏季或初秋，目前主要流行于热带亚热带地区，包括中国、日本、印度、越南等国家。乙脑主要通过蚊虫的叮咬传播，人感染乙脑病毒后主要出现高热、恶心、头痛等临床症状，严重者出现四肢僵直、神经麻痹、小脑共济失调等神经性症状。在自然界中猪是乙脑病毒最重要的扩增宿主。猪群感乙脑病毒后，易感仔猪会出现脑炎，怀孕母猪在感染后期出现流产，产死胎、木乃伊胎或畸形胎等，公猪则表现为睾丸炎、附睾硬化等。乙型脑炎病毒有一个血清型和5个基因型(基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型)，20世纪30年代以来，亚洲地区主要流行的乙型脑炎病毒是基因Ⅲ型，但随着近些年乙型脑炎病毒在水禽宿主中的适应性差异，导致病毒的优势基因型逐渐由基因Ⅲ型转变为基因Ⅰ型，此外，我国学者还在西藏等地区发现了毒力更强、致病性更高和危害更大的基因Ⅴ型毒株。因此，我国目前主要流行的乙脑病毒是基因Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅴ型，控制乙型脑炎的传播最有效的方法是进行疫苗接种，但目前我国使用的乙型脑炎疫苗(SA14-14-2弱毒活疫苗)源自GⅢ型毒株，而对GⅠ型和GⅤ型毒株的感染均不能提供完全保护。

盖他病毒(Getah virus,GETV)属于披膜病毒科甲病毒属，是一种经蚊虫在脊椎动物中传播的虫媒病毒，广泛分布于东南亚和东亚地区。盖他病毒是引起动物疾病的重要病原体，猪感染后症状表现为精神不振、食欲减退或消失、全身震颤、体温升高、腹泻、体表发红、共济失调等，严重者还可出现神经症状,甚至衰竭死亡。怀孕母猪感染盖他病毒后一般不出现临床症状,但会引起繁殖障碍，导致胚胎死亡并被吸收，从而降低母猪产仔数；妊娠前期感染该病毒可导致胚胎死亡，母猪返情，产死胎等。盖他病毒还可导致马等脊椎动物出现发热、皮疹、后退水肿，严重者出现神经症状甚至死亡。迄今，我国已经分离到至少70株盖他病毒，大多数来自三带缘库蚊和骚扰阿蚊，并发现盖他病毒在我国从东北到西南、东南到西北的广大地区均有分布，且在华北和华南地区的猪群中存在广泛流行。

乙脑病毒和盖他病毒在我国已高度流行，呈现发病迅速、传染性强以及分布范围广的特点，危害人类的健康，影响我国畜牧业的发展，造成严重的经济损失。由于乙脑病毒和盖他病毒的传播媒介相同、感染症状相似、分布区域重合，导致目前在临床上难以快速的对这两种病毒进行准确的鉴别诊断，此外，随着乙脑病毒优势基因型的逐渐转变，在乙脑暴发期间快速检测和区分乙脑病毒的基因型对于加强控制和预防乙脑至关重要。因此，我们迫切的需要开发一种能从现场样品中快速鉴别乙脑病毒和盖他病毒，并同时区分出基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒的方法。现如今，单独检测这两种病毒的常用方法包括酶联免疫吸附试验、间接血凝抑制试验、血清中和试验、免疫荧光技术、琼脂扩散试验以及RT-PCR技术等，而这些技术不仅难以支持快速鉴别乙脑病毒和盖他病毒及区分乙脑病毒基因型，而且存在操作复杂、时间长、成本高、敏感性差等缺点。因此我们开发了一种可快速、灵敏、准确的鉴别基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的基于TaqMan探针的多重RT-qPCR检测技术，这将使这两种病毒的快速检测、临床诊断以及流行病学调查等的效率大大提高，对乙脑病毒和盖他病毒的防控具有重要意义。

基于此，特提出本发明。

发明内容