[发明专利]一种改造的人工核酸酶系统及其应用

说明书

本发明涉及核酸编辑领域。具体而言，本发明提供了人工改造的Cas蛋白以及编码蛋白的核酸分子。本发明还提供了用于核酸编辑的复合物和组合物，例如基因组编辑的组合物，其包含人工改造的Cas蛋白以及编码蛋白的核酸分子。本发明还提供了用于核酸编辑的方法，例如基因敲除或基因敲入的方法，其使用包含本发明的人工改造的Cas蛋白或编码蛋白的核酸分子。

技术领域

本发明涉及核酸编辑领域。具体而言，本发明涉及人工改造的Cas蛋白以及编码蛋白的核酸分子。本发明还涉及用于核酸编辑的复合物和组合物。本发明还涉及用于核酸编辑的方法，其使用包含本发明的蛋白或编码蛋白的核酸分子。

背景技术

CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。

目前已知的CRISPR/Cas系统分为两个大类，6个类型。第二大类包括了II型、V型和VI型，其中V型的特征在于仅有一个RuvC核酸酶结构域，两次切割形成双链断裂，切割位点远离PAM。V型Cas核酸酶是一种庞大的类型，可分为多个亚型，分别为Cas12a(又名Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d和Cas12e等。其中CRISPR/Cas12a系统的双链DNA酶活性最高，被广泛开发并应用。与Cas9不同的是，Cas12a同时具有RNA内切酶活性，可结合crRNA(CRISPRRNA)前体，即pre-crRNA，并将其加工成熟。另外，相较于SpCas9，CRISPR/Cas12a系统也表现出更高的基因组靶向特异性。

目前，在哺乳动物模型内效果良好的CRISPR/LbCas12a和CRISPR/AsCas12a系统，在斑马鱼模型内仅能够通过蛋白形式递送以发挥作用，极大地限制了CRISPR/Cas12系统的进一步发展应用。而且在斑马鱼中报道使用的各类CRISPR/Cas12系统均需要热激过程，来有效地提升基因敲除或敲入的效率。但是热激过程影响胚胎正常发育，使得胚胎死亡率及畸形率升高。上述技术缺陷极大地限制了CRISPR/Cas12系统在斑马鱼模型以及各类低温(低于37℃)动物中的应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种能够避免热激过程，并对斑马鱼等低温动物(低于37℃)基因组能够进行简便高效敲除及敲入的新型CRISPR/Cas12a系统以及基于该系统的基因编辑方法。

本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括来源于直肠真杆菌(Eubacteriumrectale)的ErCas12a蛋白及融合于其N端的T5外切酶(T5exo)。

作为优选，所述T5外切酶和ErCas12a蛋白通过接头连接，其中接头优选为(GGGS)n、(EAAAK)n、SGGS-XTEN-SGGSS和Xten-linker。

作为本发明的一种优选技术方案，所述接头为Xten-linker。

作为优选，所述融合蛋白还包含一个或多个核定位信号序列(NLS)。

作为本发明的一种优选技术方案，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示，或者与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有一个或者更多个氨基酸的替换、缺失或插入，但是具有相同功能的变体。

进一步地，本发明提供了一种核酸分子，其能够编码上述融合蛋白。

作为本发明的一种优选技术方案，所述的核酸分子具有以下任一核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.2编码T5exo-Xten-ErCas12a；或，

(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，