[发明专利]以p16/Ki-67、MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法

说明书

本发明属于体外诊断医疗器械技术领域，具体公开了一种以p16/Ki‑67、MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒，包括p16/Ki‑67一抗工作混合液、MCM2一抗工作液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、DAB工作混合液、RED工作混合液和苏木素。本发明还公开了上述检测试剂盒的判读方法。采用本发明提供的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法进行子宫颈癌及癌前病变风险评估，可以精准地进行III级风险评估，亦可以精准地给予相对应的三层风险管理，同时应用于准确初筛和精准分流，灵敏度高，准确率高，阳性预测值增加，是精准的筛查方法。

技术领域

本发明属于体外诊断医疗器械技术领域，尤其涉及一种以p16/Ki-67、MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法。

背景技术

近年来，中国宫颈癌发病和死亡负担严重，且呈上升趋势，宫颈癌筛选被认为是降低宫颈癌发病率和死亡率最有效措施。宫颈癌的发病与人乳头瘤病毒(HPVs)密切相关，HPVs是一种小型双链DNA病毒，特异性感染上皮细胞，HPV家族包含约200多种病毒亚型，每种病毒亚型的组织特异性不同，大多数HPV亚型引起的病变为良性，只有少部分HPV亚型为高危亚型，可引起肿瘤。

宫颈癌及癌前病变筛查包括三个阶段，分别为子宫颈细胞学筛查(初诊)、阴道镜检(转诊)和子宫颈活检组织病理学(确诊)。

其中，子宫颈细胞学筛查需遵循以下两项基本原则：即尽可能减少高级别病变及以上(HSIL，高度的鳞状上皮内病变，CINII⁺)的漏筛和漏检(随访复查和常规筛查)的同时，亦尽可能减少低级别病变及以下(LSIL，鳞状上皮低密度病变，CINI^-)的过度筛查(阴道镜检)。子宫颈细胞学筛查经历了三个以下阶段的演变：

阶段一、(1)采用巴氏涂片法(CPS)进行初诊，具体是在宫颈移行带取材、涂片和巴氏染色，在显微镜下观察细胞形态学改变的一种方法，其诊断标准分为五级：巴氏Ⅰ级-正常、巴氏II级-炎症。巴氏Ⅲ级-可疑癌；巴氏Ⅳ级-高度可疑癌；巴氏Ⅴ级-癌。这种诊断方法虽然便宜，便于普查，但是由于细胞堆积在一起，不便于观察，准确率低。(2)LBC(液基细胞学检测)：用特制的小毛刷沿宫颈表面和宫颈管刷几圈，收集到的细胞经计算处理称为单层排列的细胞，诊断准确率高，对设备和技术的要求较高，价格偏贵。诊断标准大致分为：感染、反应性改变、上皮细胞异常(如不典型鳞状上皮细胞、低度或鳞状上皮内病变、鳞状细胞癌、不典型腺细胞、宫颈腺癌等)。

阶段二、病因生物标记物；(1)检测核酸，包括HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA；(2)检测蛋白，包括HPV L1壳蛋白和HPV E6/E7蛋白。HPV的晚期基因区(L)位于HPV DNA序列的下游，含有两个开放阅读框架，其中HPV L1编码的HPV L1壳蛋白是HPV的主要衣壳蛋白。

阶段三、病变生物标记物；(1)检测核酸：包括DNA倍体、人类染色体末端酶RNA基因(hTERC)和DNA甲基化。(2)检测蛋白：包括以p16、Ki-67、MCM2为靶标的免疫细胞化学染色法(Immunocytochemistry，ICC)。

p16基因又名多肿瘤抑癌基因(multiple tumor suppressor 1，MTS)，其在细胞核和细胞浆中表达的抑癌蛋白p16是细胞周期进展负调节蛋白。当人乳头瘤病毒整合感染宫颈上皮细胞后，引入并激活致癌基因E7，促使致癌蛋白E7表达，抑制pRB蛋白(由抑癌基因Rb编码得到)与E2F蛋白结合，促进宫颈上皮细胞增殖。当细胞增殖过度，将激活细胞增殖负反馈调节机制，即通过激活抑癌基因p16，促使抑癌蛋白p16表达，促进pRB与E2F蛋白结合，从而抑制宫颈上皮细胞过度增殖。