[发明专利]一种从头合成核黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法

权利要求书

1.一种从头合成核黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

对来自枯草芽孢杆菌的26个合成核黄素的基因进行结构优化，并化学合成，获得了优化后的26个基因；

选择T7启动子和终止子控制所述优化后的26个基因的表达，完成优化后的26个基因原核表达单元的拼接；

构建了两个不同复制起点和抗性标记的质粒pBR326和pYB8895，在两个相容质粒基础上组装了核黄素从头生物合成途径4大功能模块；

将带有4大功能模块的双质粒转入带有T7RNAP基因的大肠杆菌，获得了从头合成核黄素的含枯草杆菌26个基因原核表达单元的大肠杆菌工程菌株。

2.如权利要求1所述一种从头合成核黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的26个合成核黄素的基因为：BsGLK1、BsZWF1、BsPgl、BsGND、BsYWLF、BsPRS、BspurF、BspurD、BspurN、BspurL、BspurQ、BspurS、BspurM、BspurK、BspurE、BspurC、BspurB、BspurH、BsGuaA、BsGuaB、BsGMPK、BsNDK、BsRibA、BsRibB、BsRibG和BsRibH；

其序列号分别对应为：SEQ ID No 1、SEQ ID No 3、SEQ ID No 5、SEQ ID No 7、SEQ IDNo 9、SEQ ID No 11、SEQ ID No 13、SEQ ID No 15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQ IDNo 21、SEQ ID No 23、SEQ ID No 25、SEQ ID No 27、SEQ ID No 29、SEQ ID No 31、SEQ IDNo 33、SEQ ID No 35、SEQ ID No 37、SEQ ID No 39、SEQ ID No 41、SEQ ID No 43、SEQ IDNo 45、SEQ ID No 47、SEQ ID No 49、SEQ ID No 51。

3.如权利要求1一种从头合成核黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的26个合成核黄素的基因按密码子偏好性进行结构优化。

4.如权利要求1所述一种从头合成核黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述优化后的26个基因为：

BsGLK1S、BsZWF1S、BsPglS、BsGNDS、BsYWLFS、BsPRSS、BspurFS、BspurDS、BspurNS、BspurLS、BspurQS、BspurSS、BspurMS、BspurKS、BspurES、BspurCS、BspurBS、BspurHS、BsGuaAS、BsGuaBS、BsGMPKS、BsNDKS、BsRibAS、BsRibBS、BsRibGS和BsRibHS；

其序列号分别对应为：SEQ ID No 2、SEQ ID No 4、SEQ ID No 6、SEQ ID No 8、SEQ IDNo 10、SEQ ID No 12、SEQ ID No 14、SEQ ID No 16、SEQ ID No 18、SEQ ID No 20、SEQ IDNo 22、SEQ ID No 24、SEQ ID No 26、SEQ ID No 28、SEQ ID No 30、SEQ ID No 32、SEQ IDNo 34、SEQ ID No 36、SEQ ID No 38、SEQ ID No 40、SEQ ID No 42、SEQ ID No 44、SEQ IDNo 46、SEQ ID No 48、SEQ ID No 50、SEQ ID No 52。

5.如权利要求1所述一种从头合成核黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述4大功能模块，包括：核酮糖-5-磷酸生物合成、次黄嘌呤核苷酸生物合成、GTP生物合成和核黄素RIB生物合成。

6.如权利要求1所述一种从头合成核黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，构建了两个不同复制起点和抗性标记的质粒pBR326和pYB8895两个相容性质粒为：选择pBR322 Ori和广宿主pBBR1MCS质粒Ori的两种载体。

7.如权利要求1所述一种从头合成核黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括验证所转入的外源基因的完整性和表达，以及检验其生成核黄素的能力。