[发明专利]一种基于祖先序列重建的ω-转氨酶突变体

说明书

本发明公开了一种基于祖先序列重建的ω‑转氨酶突变体，涉及分子生物学技术领域。由来自土曲霉(Aspergillus terreus)的ω‑转氨酶突变所得，所述ω‑转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。与野生型酶相比，ω‑转氨酶突变体的半衰期均在24h以上，而野生型仅为6.90min，突变体的半失活温度分别为49.00℃和49.03℃，比野生型(37.89℃)提高了约11℃，热稳定性显著提高。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于祖先序列重建的ω-转氨酶突变体。

背景技术

手性胺是指小分子化合物手性中心含有氨基的一类化合物，是一类重要的药物合成中间体。近年来，随着手性药物市场不断扩大，手性胺及其衍生物占据手性药物的份额超过70％，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等；抗糖尿病药物的主要成分西他列汀就是R-型胺。市场对手性胺药物的需求巨大，使得高效制备手性胺药物极为重要。

转氨酶是生物法制备手性胺的关键酶，它能够可逆催化酮基与氨基之间的氨基转移反应以合成胺类化合物。来自于土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶以磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)为辅酶，催化氨基供体上的氨基转移到具有手性的受体酮上，生成手性胺和副产物酮，催化过程如下所示：

虽然转氨酶在合成手性胺方面有较好的应用前景，但野生型酶在底物特异性、稳定性、催化效率等方面还存在诸多不足，不利于将其应用到工业生产中。来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型ω-转氨酶在40℃下的半衰期仅为6.90min，需对其进行热稳定性改造。申请号为CN105441404A、CN105950581A的申请专利利用定点突变技术对ω-转氨酶野生型进行改造，获得了热稳定性进一步提高的ω-转氨酶突变体。而随着计算机技术的不断发展，通过祖先序列重建技术获得热稳定性较好的祖先酶也已成为研究热点。

祖先序列重建(Ancestral sequence reconstruction，ASR)是指通过计算机算法推导灭绝生物的祖先酶氨基酸序列的技术。基于前寒武纪时期地球环境极端，如高温且原始细胞仅依耐少数酶系的假设，一般认为祖先酶通常具有更好的热稳定性。因而利用祖先序列重建技术获得现有酶的祖先酶也成为一种提高酶的热稳定性、活性的方法，如Hendrikse等(Yosephin Gumulya,et al.Engineering highly functional thermostableproteins using ancestral sequence reconstruction.Nature Catalysis,2018,1(11):878-888.)利用祖先酶序列重建技术提高了细菌二萜类环化酶的稳定性、活性；RissoValeria等(Risso Valeria A,et al.Hyperstability and substrate promiscuity inlaboratory resurrections of Precambrianβ-lactamases.Journal of the AmericanChemical Society,2013,135(8):2899-902.)通过ASR技术获得了比现有酶更耐热的β-内酰胺酶。

目前尚无利用祖先序列重建技术获得现有酶的祖先酶的方法来提高土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶热稳定性的相关研究报道。

发明内容

本发明基于利用祖先序列重建技术获得现有酶的祖先酶的方法，通过该方法获得酶活、热稳定性进一步提高的土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶突变体。