[发明专利]一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体

说明书

本发明公开了一种L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体E88R的比酶活相对野生型提高了2.1倍，比酶活达481±3.7U/mg。突变体E88R在50℃处理30分钟仍有59％残留酶活性，在pH 7.0和pH 8.0条件下，残余酶活分别为88％和82％。相比野生型酶，该突变体酶E88R的热稳定性与pH稳定性都有很大的提高，有利于以后的工业生产。在pH 7.5条件下，突变体E88R比酶活达到199±2.1U/mg，比野生型高1.9倍。以2.5M马来酸作为底物，全细胞催化制备L‑丙氨酸，生产速率达35.66g/(L·h)，比野生型提高1.68倍。

技术领域

本发明涉及一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸(L-Ala)是一种具有重要价值的氨基酸，在日化、食品和医药行业中有着广泛的用途。在食品行业，L-丙氨酸可以作为添加剂提高饮料中蛋白质的利用率，也可以作为甜味剂提高产品甜度；L-丙氨酸也可以与谷氨酸钠制备符合调味品，改善食品风味。在医药行业，L-丙氨酸是合成维生素B₆和氨基丙醇的重要中间体。

目前工业上主要使用生物酶催化法和发酵法制备L-丙氨酸。虽然发酵法的原料廉价易得，但由于产品光学纯度差、副产物多、提取困难等缺点，生物酶催化法为绿色生产提供了良好的发展前景。

目前酶催化法合成L-丙氨酸主要利用天冬氨酸或者富马酸作为催化底物，为进一步降低成本，在申请公开号为CN112941003A的中国发明专利申请文本中记载提供了一种新的多酶级联催化路线，以马来酸作为底物进行催化。在多酶级联催化过程中，马来酸顺反异构酶MaiA催化的最适pH为8，天冬氨酸裂解酶AspA催化的最适pH为8.5，天冬氨酸β脱羧酶ASD催化的最适pH为5，为了使三种酶可以更好的协同作用，反应体系的pH值设定在pH 7.5，天冬氨酸β脱羧酶ASD无法发挥最优的催化活性，一定程度上影响了L-丙氨酸的产量。为了进一步提高L-丙氨酸的产量，亟需一种在碱性环境下兼具稳定和高活性的天冬氨酸β脱羧酶。

因此，提供一种酶活在碱性条件下酶活更高稳定性更好的L-天冬氨酸β-脱羧酶、一种高产L-丙氨酸的方法，对于工业应用生产L-丙氨酸具有重要的意义。

发明内容

氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的L-天冬氨酸β-脱羧酶的最适pH条件为酸性(pH5.0)，在碱性条件(pH 7.5)下催化活性较低。本发明通过对其进行基因突变，构建得到一个在碱性条件下酶活提高且稳定性提高的突变体E88R。

本发明的第一个目的是提供一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示列。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供携带所述基因，或所述载体的细胞。

本发明的第五个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达上述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET28a。

本发明的第六个目的是提供一种提高L-天冬氨酸β-脱羧酶稳定性的方法，所述方法是将将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的L-天冬氨酸β-脱羧酶的第88位谷氨酸突变为精氨酸。