[发明专利]抗SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD单克隆抗体

说明书

本发明提供了一种抗SARS‑CoV‑2(COVID‑19)S蛋白RBD单克隆抗体。实验证实，该抗体与SARS‑CoV‑2(COVID‑19)S蛋白RBD及其突变体均具有高亲和力，可有效抑制SARS‑CoV‑2(COVID‑19)S蛋白RBD及其突变体(L452R，T478K)与ACE2的结合，且对新冠假病毒及其突变株(Delta)假病毒具有明显的中和活性。

技术领域：

本发明涉及基因工程抗体，特别涉及针对新冠病毒S-RBD靶点开发的单克隆抗体药物。

背景技术：

已知新冠病毒SARS-CoV-2(COVID-19)是通过其S蛋白的受体结合结构域(RBD)与宿主受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，介导病毒进入宿主细胞而感染的。S蛋白包含两个功能性亚基S1和S2，其中S1负责与宿主细胞受体结合，S2亚基负责病毒膜和细胞膜融合。在感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，并从融合前状态转变为融合后状态。S1和S2由胞外结构域(ECD)和单个跨膜螺旋组成，分别介导受体结合和膜融合。S1由N端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)组成，对决定组织嗜性和宿主范围至关重要。

SARS-CoV-2(COVID-19)的S蛋白的受体结合结构域(RBD)是免疫显性的，也是SARS-CoV-2免疫血清中存在的90％中和抗体的靶点。因此，针对新冠病毒S-RBD靶点及其突变体开发抗体药物是治疗新冠病毒感染患者的有效途径，据此开发的单克隆抗体有潜力成为新冠病毒感染治疗的特效药。

发明内容

本发明的目的是提供一种单克隆抗体，可以有效与ACE2竞争结合SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD及其突变体(L452R，T478K)，用于制备治疗新型冠状病毒相关疾病的药物。

本发明用SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD蛋白及其突变体(L452R，T478K)蛋白免疫BALB/c小鼠，获得了全新的抗SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD单克隆抗体。

本发明获得的抗SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD单克隆抗体的重链和轻链序列，与现有技术抗SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD单克隆抗体均完全不同。

所用的SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD蛋白购买自北京百普赛斯生物科技股份有限公司，所用的小鼠为BALB/c小鼠。

具体的，本发明通过如下手段完成了上述工作：

A SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD蛋白作为抗原，以30μg/只免疫BALB/c小鼠，三周后同样剂量加强免疫；

B ELISA法测定免疫后小鼠血清中的抗体滴度，达到理想效果后以50μg剂量冲击免疫；

C取免疫成功的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，待细胞长成细胞团后进行上清滴度检测，通过三轮亚克隆获得阳性单克隆细胞株；

D单克隆细胞株扩大培养后进行小鼠腹腔注射制备腹水，并从收集的腹水纯化得到相应的抗体；

E利用SPR技术进行单克隆抗体的亲和动力学测定；

F测定单克隆抗体对SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD及其突变体(L452R，T478K)与ACE2结合的竞争抑制作用；

G测定单克隆抗体对于新冠假病毒及其突变株(Delta)假病毒的中和活性。

本发明获得的抗SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD单克隆抗体命名为B15-5-B3。此抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，这些区域是与抗原结合的关键部位。