[发明专利]一种在人血清白蛋白内部融合多肽的方法

说明书

本发明公开一种在人血清白蛋白内部融合多肽的方法。本发明所述方法是以HSA的晶体结构为基础，选择在HSA的两个转弯C168‑C177与C360‑C369上，通过基因融合插入具有生物活性的多肽；所选择的两个转弯位于HSA三级结构表面且向外凸，结构紧凑，因此该方法不影响HSA的二级结构及药物结合能力，而且能够维持多肽的高生物活性。在生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究领域具有重要应用价值。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种在人血清白蛋白内部融合多肽的方法。

背景技术

人血清白蛋白 (human serum albumin, HSA) 是血浆的主要成分，在血浆中的浓度为35 ~ 50 mg/ml。HSA由 585 个氨基酸组成，其相对分子质量约为 66.5kDa，正常情况下不易透过肾小球，故半衰期长达19天。HSA既可以通过化学结合也可以通过基因融合有效延长目的蛋白或多肽的半衰期，是一种理想的生物活性蛋白或多肽的载体。

HSA融合技术是指利用基因工程技术，将目的蛋白基因与 HSA 基因融合后，选择合适的系统进行表达，最终获得半衰期更长的药物，已经发展成为蛋白质药物长效化改造的一个通用技术，近年来在长效干扰素、粒细胞生长因子以及白介素等药物的研制上得到了广泛的应用。通常，多肽都是融合在HSA的N端或C端，然而，这种首尾相连的融合方式往往会降低多肽的活性。据报道，将胰高血糖素样肽-1受体 (GLP-1R)的一个多肽激动剂AGLP-1融合在HSA的N端有效延长了其半衰期，然而相比于AGLP-1，融合蛋白与GLP-1R的结合能力降低了100倍。同样地，生长抑素-14 (somatostatin-14, SST-14)对所有生长抑素受体亚型(somatostatin receptor subtypes, SSTRS)都具有高亲和活性。然而，将两段重复的SST-14融合在HSA的N端，所得到的融合蛋白(SST14)₂-HSA对所有受体亚型的亲和活性都降低了。相比于SST-14，(SST14)₂-HSA 对5种SSTR的亲和力都表现出不同程度的下降。

因此，为了维持多肽的高生物活性，构建多肽与HSA的融合蛋白时，合适的融合位点非常重要。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种在人血清白蛋白（HSA）内部融合多肽的方法。该方法基于HSA的晶体结构，找到新的适合融合多肽的位点，即两段位于HSA三级结构表面的两个转弯 (C168-C177与C360-C369) 上，提供一种在HSA内部融合多肽且维持多肽高活性的融合方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种在人血清白蛋白（HSA）内部融合多肽的方法：将具有生物活性的多肽融合在人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)结构域Ⅰ和Ⅱ的两条α螺旋链之间两段转弯C168-C177与C360-C369 位点上。

上述两段转弯 C168-C177与C360-C369 位点，附近存在两对二硫键 C168-C177和C169-C124 ； C360-C369和C361-C316；结构紧凑，有利于维持多肽的活性构象；且该两段转弯位于HSA表面并向外凸出，有利于消除HSA与多肽之间以及融合蛋白与靶向受体之间的空间位阻；该两段转弯远离HSA与新生儿Fc受体(FcRn)的结合位点，有利于保持HSA长达19天半衰期的特性，改善融合多肽的药代动力学性质。

上述具有生物活性的多肽包括但不限于：氨基酸序列为CVSNKYFSNIHWC多肽；或氨基酸序列为CPAYSRYIGC的多肽。

一种在人血清白蛋白（HSA）内部融合多肽的方法，包括以下步骤：

（1）内部融合位点选择：内部融合位点选择位于HSA结构域Ⅰ和Ⅱ的两条α螺旋链之间两段转弯C168-C177与C360-C369上；