[发明专利]一种快速获得凤眼莲无菌苗的方法

权利要求书

1.一种快速获得凤眼莲无菌苗的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)前处理：对凤眼莲植株进行前处理，获得消毒风干的芽体；

2)组织培养：将步骤1)所得芽体插入固体培养基中，28℃，黑暗培养12h，转入固体培养基中培养至新芽长出，培养时L：D为12：12；

3)再次组织培养：在超净台中取出凤眼莲外植体，用解剖刀切除黑化老化部位，转入固体培养基中，28℃，黑暗培养12h，再在L：D为12：12的固体培养基中培养；

4)转接：培养至匍匐茎上长出新芽，用解剖刀切断后，去除新芽基部的匍匐茎，转入固体培养基中在温度28℃，L：D为12：12的环境下培养至匍匐茎上长出新芽；重复步骤3)；

5)增殖：去除匍匐茎后的母株，切除老叶及黑腐组织后，转入液体培养基1中在温度28℃，L：D为12：12的环境下培养，若有匍匐枝长出，用解剖刀切下，去除黑腐组织及多余的匍匐枝，转入液体培养基1，母株转入液体培养基2；

6)循环培养：反复循环培养，获得无菌子代凤眼莲；

步骤1)中，所述前处理具体包括下述步骤：

11)取回已长出匍匐枝的凤眼莲，在清水中培养1周，去掉匍匐枝，距离茎基部2-3cm处剪去叶片，除去根部，用清水洗净后，放在通风处彻底吹干；

12)把多余的叶柄及茎部去除，仅留中间最大的芽，切根的时候不要伤到中间的芽，用洗涤剂清洗1-2遍，风干；

13)芽体风干后，用75％浓度的酒精表面消毒30s，转入超净台操作，取出后用无菌水冲洗一遍，灭菌吸水纸吸干；

14)以0.1％升汞加入吐温-20表面消毒5min，在超净台中密封好后，放超声波震动清洗2.5min，处理结束后用无菌水冲洗3遍，灭菌吸水纸吸干，放无菌托盘上风干；

15)切除多余的叶柄及茎部组织，只留中间最大的芽；

所述液体培养基1配方包括：NH₄NO₃ 825mg/L、KNO₃ 950mg/L、MgSO ₄.7H₂O 185mg/L、KH₂PO₄ 85mg/L、CaCl².2H₂O 220mg/L、KI 0.83mg/L、H₃BO₃ 6.2mg/L、MnSO₄.4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄.7H₂O 8.6mg/L、Na₂MoO₄.2H₂O 0.25mg/L、CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L、CoCl₂.6H₂O0.025mg/L、FeSO₄.7H₂O13.9mg/L、Na₂-EDTA.2H₂O、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤1mg/L、1％蔗糖，pH值为6.5；

所述液体培养基2配方包括：NH₄NO₃ 825mg/L、KNO₃ 950mg/L、MgS O₄.7H₂O 185mg/L、KH₂PO₄ 85mg/L、CaCl₂.2H₂O 220mg/L、KI 0.83mg/L、H₃BO₃ 6.2mg/L、MnSO₄.4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄.7H₂O 8.6mg/L、Na₂MoO₄.2H₂O 0.25mg/L、CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L、CoCl₂.6H₂O0.025mg/L、FeSO₄.7H₂O13.9mg/L、Na₂-EDTA.2H₂O、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、1％蔗糖，pH值为6.5。