[发明专利]一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法

说明书

本发明提供一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法，属于基因工程技术领域。本发明提供一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，可以进行精确的基因定点突变；由sgRNA、Cas9和同源重组片段建立基因编辑系统，可精确地将毒害艾美耳球虫的NA4蛋白和荧光标签蛋白等同源片段同源重组于ETH_00009555基因，构建一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体。所述重组球虫载体DNA经过PCR检测和测序，表明已成功重组于ETH_00009555基因；且重组球虫载体在荧光显微镜下具有明显的荧光信号，表明其已成功表达NA4蛋白和荧光标签蛋白。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法。

背景技术

毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)可引起9～14周龄的后备母鸡和种鸡发生急性小肠球虫病，不仅侵害小肠中段，引起小肠肠壁扩张、增厚、局部组织浅层和深层黏膜的严重损伤，严重影响肠道吸收功能，同时对盲肠黏膜造成损伤，表现中度的炎症反应。由于鸡球虫的虫种之间无交叉免疫作用，感染柔嫩艾美耳球虫的鸡群，在受到毒害艾美耳球虫感染时，还会导致同一鸡群暴发二次球虫病，给农户带来二次损失。

专利CN107647163A公开了一种球虫疫苗的吸附拌料免疫方法，将球虫疫苗稀释，与可食用、吸水能力强且容易分散的吸附剂均匀混合，使球虫卵囊能够附着在吸附剂上。将混合后的吸附剂与鸡饲料混合供鸡食用从而获得免疫。

专利CN109432006A公开了球虫疫苗喷滴免疫用佐剂，所述佐剂包括瓜尔胶10～34份，壳寡糖2～34份，吹干粉1.5～10份，食用色素1.5～7份，以及无水葡萄糖15～85份。所述佐剂在常温下能够快速溶解在疫苗稀释液中，将佐剂与疫苗稀释液混合均匀，将混合后的液体通过喷滴设备直接喷洒在鸡只上，使雏鸡快速建立免疫。该方法适用于集约化养鸡场和大型孵化场中，能够快速使雏鸡建立免疫，但这种方法需要多次进行免疫，需要的时间长，在尚未建立免疫前，鸡群仍然有爆发球虫病的风险。

目前国内市场上普遍使用预防球虫病的方法是使用多价弱毒活疫苗通过饮水或拌料免疫，但毒害艾美耳球虫弱毒活疫苗免疫效果并不理想，免疫保护建立较为困难。因此，研制同时预防毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫药物和/或疫苗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达NA4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法。所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA特异性强，脱靶率低，与Cas9核酸酶配合，可实现在柔嫩艾美耳球虫的ETH_00009555基因上插入NA4基因。本发明还提供一种ETH_00009555基因编辑系统，所述ETH_00009555基因编辑系统的基因编辑效率高，制备得到的重组球虫载体的基因型可稳定存在，应用价值高。所述重组球虫载体能表达NA4蛋白，所述NA4蛋白能刺激鸡产生中和性抗体抵抗毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的感染，所述重组球虫载体能够用于研发同时预防毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的球虫疫苗，其免疫效果更为高效安全。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA的核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列。

本发明中所述ETH_00009555基因的核苷酸序列来自于NCBI。

SEQ ID No.1：aataggccgaccagacggtg。

本发明中，所述sgRNA靶向ETH_00009555基因中的非编码区序列，所述sgRNA具有良好的特异性与靶向性，脱靶率低，编辑效率高。

第二方面，本发明提供一种ETH_00009555基因编辑系统，所述ETH_00009555基因编辑系统包括第一方面所述的靶向ETH_00009555基因的sgRNA。