[发明专利]一种基于微流控阻抗法检测病毒的方法

权利要求书

1.一种基于微流控阻抗法检测病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、芯片设计及参数设置：制作和设计微流控芯片，同时设置好相应的阻抗测试参数，然后搭建检测平台；

S2、裸电极测量：注入PBS缓冲液测量裸电极的阻抗值，测量完成后持续注入超纯水3min清洗微通道及微电极；

S3、抗体固定：注入15μL0.5mg/mL的ToRSV抗体使之充满微通道，静置2h，在此期间，由于抗体蛋白对金属金的吸附性，抗体会被非特异性地吸附在金电极表面，2h之后用超纯水清洗除去未吸附的抗体，注入PBS缓冲液测量阻抗值,测量完成后重复清洗操作；

S4、BSA封闭：注入15μL1％BSA溶液，静置30min，其作用是封闭未被抗体附着的金电极表面，以免产生多余的干扰信号，30min后清洗掉多余的BSA，注入PBS缓冲液测量阻抗值，测量完成后重复清洗操作；

S5、ToRSV检测：注入15μL所需浓度的ToRSV样品，静置30min，测量阻抗值，测量完成后重复清洗操作，直至阻抗与裸电极测量时相似。

2.根据权利要求1所述的一种基于微流控阻抗法检测病毒的方法，其特征在于：所述步骤S1中微流控芯片的总设计尺寸参数为微通道长30mm、宽3mm、深100μm，储液池和废液池的尺寸参数为直径3mm，深100μm，微叉指金电极设置在距微通道入口三分之一处，其参数为电极对数20对、电极长0.6mm、宽15μm、高100nm、各电极间距15μm，微反应室的体积为1.2mm×3mm×0.1mm＝36nl，在盖片层对应储液池和废液池的中心用注射针头打孔以便预留进口和出口，直径为0.5mm，连接导管用于样液的输入和排出，叉指电极外接到电极板，用与检测电极连接，电极板面积为5mm×5mm＝25mm2。

3.根据权利要求1所述的一种基于微流控阻抗法检测病毒的方法，其特征在于：所述步骤S1中阻抗测试参数设置为：将注射泵注入流速设定为10μL/min，电化学工作站阻抗测试参数设定为：交流激励电压为100mV，测试频率为1Hz～100KHz，每一个数量级取10个数据点，频率范围内共选取50个数据点。

4.根据权利要求1所述的一种基于微流控阻抗法检测病毒的方法，其特征在于：所述步骤S3之前进行样本制备：

a、先于1.5mL离心管中加入500μl植物蛋白提取液A、4ul蛋白稳定剂和2μl蛋白酶抑制剂，用恒温混匀仪混匀备用。

b、往研钵中倒入液氮，加入带番茄环斑病毒的植物叶片研磨充分，装入上述备好的1.5ml离心管中。

c、将离心管放入4°混匀仪中，速度800rpm，振荡1小时，随后放入4°冷冻离心机中，速度12000rpm，离心15min。

d、提取离心管中的上清液到一个新的1.5ml离心管中，测定番茄环斑病毒浓度，用PBS缓冲液分别稀释至10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL和0.001μg/mL，于-20℃保存备用。

5.根据权利要求1所述的一种基于微流控阻抗法检测病毒的方法，其特征在于：所述步骤S2-S5的检测环境选择为室温恒温25℃。

6.根据权利要求1所述的一种基于微流控阻抗法检测病毒的方法，其特征在于：所述步骤S5之后还建立面向ToRSV检测的等效电路模型，该等效电路模型包括溶液电阻(Rs)、电子转移电阻(Ret)、双电层电容(Cdl)和介电电容(Cdi)，溶液电阻(Rs)与双电层电容(Cdl)和电子转移电阻(Ret)的并联电路串联，介电电容(Cdi)与溶液电阻(Rs)、双电层电容(Cdl)和电子转移电阻(Ret)的电路并联，然后将50个数据点进行等效电路拟合，使用的方法是复杂非线性最小二乘法。

7.根据权利要求1所述的一种基于微流控阻抗法检测病毒的方法，其特征在于：所述步骤S3中用超纯水清洗除去未吸附的抗体时还掺加有多根净化纤维束，所述净化纤维束包括主纤维束(1)、一对磁引端(2)以及多根副纤维丝(3)，所述磁引端(2)对称连接于主纤维束(1)两端，所述副纤维丝(3)均匀连接于主纤维束(1)外表面。