[发明专利]一种自主构建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞系筛选CTL表位方法

权利要求书

1.一种自主构建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞系筛选CTL表位方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤S1：多肽表位合成；其中，多肽序列如下：

步骤S2：PK15、sT2和SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞系亲和力实验；

步骤S3：筛选肽类条件；

步骤S4：CTL表位筛选；

步骤S5：激光共聚焦检测。

2.如权利要求1所述的一种自主构建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞系筛选CTL表位方法，其特征是，所述步骤S2具体步骤为：

(1)选取状态较好的PK15、sT2和SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞，分别给3种细胞计数，均为4×10⁶个细胞，于37℃、5％的CO₂培养箱中培养12h后，分别给细胞负载EB155肽类，浓度为50ug/mL，培养16h，同时设置对照组；

(2)孵育细胞后，从培养箱中取出细胞，预冷1×PBS洗涤2-3次，消化收集细胞，计数后取1×10⁶个细胞；

(3)4％多聚甲醛，室温固定20min，预冷1×PBS洗2次，然后用0.22μm微膜过滤的3％BSA室温封闭10min，1×PBS冲洗2次；

(4)向3个细胞中加入200μL 1:500倍1×PBS稀释的β2m单克隆抗体，4℃孵育1h，冷的1×PBS冲洗2-3次，除去未结合的特殊抗体；

(5)加入200μL 1:500倍1×PBS稀释的PE Rat anti-Mouse IgG溶液，室温下避光孵育1h，预冷1×PBS洗2次，加500μL 1×PBS重悬，过滤后用流式细胞仪进行检测。

3.如权利要求1所述的一种自主构建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞系筛选CTL表位方法，其特征是，所述步骤S3具体步骤为：

(1)外源性肽类添加条件选择

①选取状态较好的sT2和SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞系，计数后接4×10⁶个细胞，sT2细胞一板，SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞四板，于37℃、5％的CO₂培养箱中培养12h后，分别进行不同处理：sT2细胞未处理；SLA-2-HB01-pCDH/sT2未处理；SLA-2-HB01-pCDH/sT2加入3μg/mLβ2m；SLA-2-HB01-pCDH/sT2加入50μg/mL AS63；SLA-2-HB01-pCDH/sT2加入3μg/mLβ2m和50μg/mL AS63于37℃、5％的CO₂培养箱中培养16h；

②孵育细胞后，从培养箱中取出细胞，预冷1×PBS洗涤2-3次，消化收集细胞，计数后取1×10⁶个细胞；

③4％多聚甲醛，室温固定20min，预冷1×PBS洗2次，然后用0.22微膜过滤的3％BSA室温封闭10min，1×PBS冲洗2次；

④向细胞中加入200μL 1:500倍1×PBS稀释的β2m单克隆抗体，4℃孵育1h，冷的1×PBS冲洗2-3次，除去未结合的特殊抗体；

⑤加入200μL 1:500倍1×PBS稀释的PE Rat anti-Mouse IgG溶液，室温下避光孵育1h，预冷1×PBS洗2次，加500μL 1×PBS重悬，过滤后用流式细胞仪进行检测；

(2)筛选肽类时间选择

在前期实验基础上，选取状态较好的sT2和SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞系，计数后接4×10⁶个细胞，sT2细胞一板，SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞6板，于37℃、5％CO₂培养箱中培养12h后，分别在5板SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞中负载50μg/mL AS63和3μg/mL β2m，然后于37℃、5％的CO₂培养箱中培养3h、6h、12h、16h、18h；细胞孵育后，处理方法同步骤S2(1)中方法一样，进行流式检测；

(3)已转染sT2细胞系中肽类筛选

在前期实验基础上，选取状态较好的sT2、SLA-2-HB01-pCDH/sT2、SLA-2-HB01-Flag-pCDH/sT2和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH/sT2细胞系，分别接种4×10⁶个细胞培养后，分别加入50μg/mL AS63和3μg/mL β2m，然后于37℃、5％的CO₂培养箱中培养18h，细胞孵育后，处理方法同步骤S2(1)中方法一样，进行流式检测。